[發明專利]一種堆肥發酵液提高黑麥草抗Cr和Cd能力的方法

無效

• 申請號: 201210051928.3
• 申請日: 2012-03-02
• 公開（公告）號: CN102598977A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 趙樹蘭;多立安;程田
• 申請（專利權）人: 天津師范大學
• 主分類號: A01G1/00
• 分類號: A01G1/00;A01G7/00;C12N1/20;C12R1/07
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

1.?一種堆肥發酵液提高黑麥草抗Cr和Cd能力的方法，其特征在于按如下的步驟進行：

(1)蘇云金芽孢桿菌的分離：

1）將新鮮堆肥樣品稱取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml無菌水三角瓶中，振蕩，使樣品中的微生物充分且均勻分布于液體中，用移液槍在三角瓶中取lml母液，加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，此為l0^-1濃度的稀釋溶液，按此方法分別稀釋成l0^-2、l0^-3、l0^-4、l0^-5、l0^-6幾種濃度的堆肥稀釋液；分別用移液槍吸取0.1毫升濃度為l0^-2、l0^-3、l0^-4、l0^-5、l0^-6稀釋液，注入到牛肉膏蛋白胨固體平板培養基上，每一稀釋度重復三次，無菌水為空白對照；用無菌玻璃刮刀將菌懸液均勻涂抹在整牛肉膏蛋白胨固體培養基上，使微生物均勻分布，將含有牛肉膏蛋白胨固體培養基的平板倒置于37℃恒溫培養箱中培養1天；

2）蘇云金芽孢桿菌發酵液的制備：

A.將分離出的蘇云金芽孢桿菌菌種純化培養2代；然后接入裝有50mL牛肉膏蛋白胨液體培養基的250?mL三角瓶中，180?r/min37℃培養，選用600nm波長進行比濁測定，以菌懸液的OD值為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制微生物的生長曲線，根據生長曲線獲得蘇云金芽孢桿菌生長至穩定期的時間；

B.取純化蘇云金芽孢桿菌菌種，接入裝有50mL高氏一號液體培養基的250?mL三角瓶中，180?r/min37℃培養8～12?h至穩定期，取穩定期的菌種采用顯微鏡直接計數法計算每mL菌液中的活菌數，將穩定期的菌液進行抽濾，抽濾后將菌液通過孔徑為0.22um的微孔濾膜，獲得的過濾液則為微生物發酵后的過濾液；

3）稀釋蘇云金芽孢桿菌發酵液：

取一部分過濾液分別稀釋至4倍濾液和8倍濾液，備用；

4）堆肥發酵液提高黑麥草對Cr和Cd抗性能力的方法：

在直徑為7cm的一次性塑料杯中加入200g烘干土壤，并播種黑麥草種子0.5g，待播種10d后，分別向草坪植物上加入1ml堆肥發酵液，對照組加入無菌液體培養基，加菌劑生長5d后，向土壤中分別加入氯化鎘和重鉻酸鉀溶液，實驗為3次重復，共60個樣品，室內適溫繼續培養，實驗期間每天定量給水，保證各個處理間環境一致，待其生長30天后測定各項指標；

其中的純化培養2代培養指的是：用接菌環直接挑起待純化的菌落，接種到事先準備好的高氏一號平板固體培養基中，在平板上自左向右輕輕劃線，將培養皿倒置于37℃恒溫培養箱中培養1天，此過程為純化一代，從純化一代的菌種中挑取菌落再重復此過程為純化二代。