[發明專利]用于檢測新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單抗和酶聯免疫方法與試劑盒有效

申請號：	201210045202.9	申請日：	2012-02-27
公開（公告）號：	CN102585006A	公開（公告）日：	2012-07-18
發明（設計）人：	袁宗輝;王玉蓮;閆彩霞;彭大鵬;潘源虎;黃玲利;陳冬梅;陶燕飛;戴夢紅;劉振利;廖峰	申請（專利權）人：	華中農業大學
主分類號：	C07K16/44	分類號：	C07K16/44;C12N5/20;G01N33/577;C12R1/91
代理公司：	武漢開元知識產權代理有限公司 42104	代理人：	樊戎
地址：	430070 湖***	國省代碼：	湖北;42
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摘要：
搜索關鍵詞：	用于檢測新霉素阿米卡星霉素免疫方法試劑盒
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及一種能識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體和一種用于檢測新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的酶聯免疫方法及試劑盒。

背景技術

氨基糖苷類(AMGs)抗生素是由鏈霉菌或小單孢菌培養液中提取，或以天然品為原料半合成制取而得到的一類水溶性堿性抗生素。目前獸醫臨床常用的有：鏈霉素、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、阿米卡星等。其對多數革蘭陰性桿菌顯示強力殺菌作用，對革蘭陽性細菌也有作用，主要敏感菌為腸桿菌敏感菌株，對鏈球菌、肝炎球菌、梭狀芽孢桿菌屬、立克次氏體有效。然而由于AMGs易在腎皮質和內耳外淋巴液蓄積而引起耳毒性和腎毒性以及由氨基糖苷類鈍化酶產生的微生物耐藥株較為嚴重，因此其在動物源性食品中的檢測日益引起人們的重視。鑒于AMGs的毒副作用，各個國家對AMGs的最大殘留限量都作了嚴格規定。酶聯免疫檢測方法(enzyme-linked?immunosorbent?assay，ELISA)因為具有簡單、快速、靈敏、特異等優點而被逐漸廣泛應用于AMGs的快速檢測領域。但目前的ELISA方法主要集中在單殘留檢測方面，用一種抗體同時檢測結構不同的AMGs的ELISA方法很少。因此，建立可以檢測多種AMGs的ELISA方法對于完善該類藥物的快速檢測具有重要的意義。

申請號為200610171540.1的發明專利公開了一種檢測新霉素的酶聯免疫試劑盒，該專利將新霉素和人血清白蛋白采用碳二亞胺(EDC)法進行偶聯得到免疫原；采用兔血清白蛋白為載體，新霉素為半抗原，用羧甲基羥胺-碳二亞胺法偶聯得到新霉素包被原，所制備的多克隆抗體和單克隆抗體同樣只能識別新霉素，而且樣品的檢測時間較長。申請號為200710064347的發明專利公開了一種檢測新霉素藥物的酶聯免疫試劑盒及方法，該專利采用直接活化蛋白的方法偶聯新霉素和牛血清白蛋白(bovine?serum?albu分鐘，BSA)獲得免疫原，同樣的方法將新霉素和甲狀腺蛋白偶聯獲得包被原，所制備的單克隆抗體同樣僅能特異性識別新霉素，而且樣品處理時間和試劑沒有進行優化。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種能同時識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體。

本發明的第二個目的是利用該單克隆抗體，建立一種能用于新霉素、阿米卡星和巴龍霉素檢測的酶聯免疫方法。

本發明的第三個目的是提供一種用于新霉素、阿米卡星和巴龍霉素檢測的試劑盒。

本發明的第四個目的是提供所述單克隆抗體在制備檢測新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的酶聯免疫試劑盒中的應用。

本發明的第五個目的是提供含有所述單克隆抗體的試劑盒在動物組織新霉素、阿米卡星和巴龍霉素殘留檢測中的應用。

本發明通過以下技術方案實現：

一種能識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體，它是由保藏號為CCTCC?NO：C201144的雜交瘤細胞EDC/5G04所分泌的。

上述雜交瘤細胞EDC/5G04，保藏在位于湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為CCTCC?NO：C201144。

所用的免疫原是由半抗原新霉素與牛血清白蛋白偶聯制備的。

進一步，本發明提供了一種同時檢測新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的酶聯免疫檢測方法，該方法包括免疫原、包被原、抗體的制備以及樣品的處理和檢測等步驟，具體如下：

(1)將半抗原新霉素與牛血清白蛋白(BSA)偶聯得到免疫原；