[發明專利]實時監測蛋白水解酶活性的指示劑的制備方法及應用方法

無效

• 申請號: 201210042854.7
• 申請日: 2012-02-24
• 公開（公告）號: CN102558310A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 李兵輝;張矯
• 申請（專利權）人: 李兵輝
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C12N15/11;C12Q1/37;G01N21/64
• 代理公司: 淮安市科翔專利商標事務所 32110
• 代理人: 韓曉斌

1.實時監測蛋白水解酶的指示劑的制備方法，用于實時監測蛋白水解酶活性的工具為由熒光蛋白改造而成的蛋白水解酶活性指示劑（PAI），其特征在于該指示劑的制備方法是：對熒光蛋白進行循環置換，用蛋白水解酶識別序列將N端和C端連接改變它們的空間結構，同時產生新的N端和C端，經循環置換后的熒光蛋白即為蛋白水解酶活性指示劑（PAI），PAI沒有熒光，在經相應的蛋白水解酶作用后，PAI變成由熒光蛋白的N端和C端兩部分肽段組成，這兩部分經熒光互補產生熒光，PAI能由基因直接編碼。

2.根據權利要求1所述的實時監測蛋白水解酶的指示劑的制備方法，其特征在于該指示劑的具體制備步驟如下：

（1）將熒光蛋白游離的N端與C端通過分子生物學技術縮短，但保證熒光蛋白發熒光的功能，產生的N端和C端命名為N₁和C₁；

（2）在熒光蛋白內部的某位點將肽鍵切斷，形成新的游離的N端與C端，命名為N₂和C₂；

（3）用蛋白水解酶識別位點（較短的多肽序列）連接縮短后的熒光蛋白的N₁端與C₁端，構成一個完整的蛋白，該蛋白即為蛋白水解酶活性指示劑，Protease?Activity?Indicator，命名為：PAI。

3.根據權利要求1所述的實時監測蛋白水解酶的指示劑的制備方法，其特征在于：以Venus為基礎生產的用于監測蛋白水解酶Caspase-3活性的蛋白水解酶活性指示劑（PAI-C3）的cDNA（基因）：

???該基因對應編碼的氨基酸序列為：

劃單下劃線的序列編碼Venus熒光蛋白的C端多肽；劃雙下劃線的序列編碼Venus熒光蛋白的N端多肽；中間的序列編碼Caspase-3水解酶的識別和水解位點（DEVDG）。

4.根據權利要求3所述的實時監測蛋白水解酶的指示劑的制備方法，其特征在于：此處熒光蛋白的C端和N端可替換為其它具有β-桶裝結構的熒光蛋白；Caspase-3的水解位點可替換為其它水解蛋白：Caspase-1—Caspase13、Trypsin、HIV-1?Protease、site-1?Protease。

5.實時監測蛋白水解酶的指示劑的應用方法，其特征在于該應用方法包括以下步驟：

（1）構建質粒：

（a）將熒光蛋白游離的N端與C端通過分子生物學技術縮短，保證熒光蛋白功能較短序列，最短最好，但不是必須的；

（b）在熒光蛋白的某特定位點，在EGFP及其衍生的熒光蛋白的不限與此的第154與155殘基之間，將其切斷，形成N端與C端兩部分多肽片段；

??????????（c）連接縮短后的N端與C端，同時插入某一蛋白水解酶的識別位點，使兩個多肽成為一個完整的蛋白，即為蛋白水解酶活性的指示劑（PAI）；

???????????（d）將表達以上指示劑（PAI）的cDNA連接到合適的載體上，構建完整質粒，用于在生命體系中表達；

（2）在體內或體外通過指示劑（PAI）熒光的有無強弱的變化，監測蛋白水解酶活性的變化。

6.根據權利要求3所述的實時監測蛋白水解酶的指示劑的制備方法，其特征在于：以權利要求3中所述的基因（cDNA）為基礎衍生的各種表達載體制備成的監測蛋白水解酶活性的試劑或試劑盒。

7.根據權利要求2所述的實時監測蛋白水解酶的指示劑的制備方法，其特征在于：以權利要求4中所述的PAI為基礎生產的監測蛋白水解酶活性的試劑或試劑盒。