[發明專利]環介導等溫擴增禽傳染性支氣管炎病毒的引物、檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201210040491.3
• 申請日: 2012-02-22
• 公開（公告）號: CN102605100A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 張琳;張秀美;胡北俠;楊少華;顏世敢
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

1.一種環介導等溫擴增禽傳染性支氣管炎病毒的引物，其特征在于共包括外側引物對、內側引物對和環形引物對三對特異性引物，序列如下：

外側引物對：

上游引物F3：5’-TTAGATTTAGTTTATAGGTTGG-3’,

下游引物B3：?5’-CCTTACCGCTTGCCATGA-3’,

內側引物對:

上游引物FIP：

?5’-AACACAATCTAATCCTTCTCTCATTTTGTATGAATAATAGTAAAGATAATCC-3’,

下游引物BIP：

5’-TACTTTCTTAACAAAGCAGGACATTTTCACAAGTTTTCCCTTGGAATA-3’,

環形引物對:

上游引物LF：5’-CTTTTCTTGCTATTGCTCC-3’,

下游引物LB：?5’-CAGAGCCTTGTCCCGCGT-3’，

外側引物對、內側引物對、環形引物對的摩爾比為1:8:4。

2.一種禽傳染性支氣管炎病毒的檢測試劑盒，其特征在于包括環介導等溫擴增反應液，環介導等溫擴增反應液中含有權利要求1中的三對特異性引物。

3.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于每24μL環介導等溫擴增反應液中含有外側引物對上游引物和下游引物各5pmol，內側引物對上游引物和下游引物各40pmol，環形引物對上游引物和下游引物各20pmol。

4.根據權利要求2或3所述的檢測試劑盒，其特征在于每24μL環介導等溫擴增反應液中還含有Tris-HCl?20mM、KCl?10mM、(NH₄)₂SO_4?10mM、MgSO₄?4-16mM、Tween20?0.1%、鈣黃綠素0.05?mM、MnCl₂?0.6mM、AMV反轉錄酶?0.2U、甜菜堿?0.8M、脫氧核苷酸dNTPs?1.4mM、Bst聚合酶8U。

5.根據權利要求2或3所述的檢測試劑盒，特征在于每24μL環介導等溫擴增反應液中還含有Tris-HCl?20mM、KCl?10mM、(NH₄)₂SO_4?10mM、MgSO₄?8mM、Tween20?0.1%、鈣黃綠素0.05?mM、MnCl₂?0.6mM、AMV反轉錄酶?0.2U、甜菜堿?0.8M、脫氧核苷酸dNTPs?1.4mM、Bst聚合酶8U。

6.根據權利要求2或3所述的檢測試劑盒，特征在于所述的檢測試劑盒中還包括熒光顯色劑。

7.根據權利要求6所述的檢測試劑盒，特征在于熒光顯色劑為鈣黃綠素和MnCl₂。

8.一種禽傳染性支氣管炎病毒的檢測方法，其特征是使用權利要求2或3所述的檢測試劑盒對樣品RNA進行環介導等溫擴增反應，同時設置陽性對照組和陰性對照組，所述環介導等溫擴增反應條件為：59-65℃、30-75分鐘。

9.根據權利要求8所述的檢測方法，其特征在于將進行完環介導等溫擴增反應的樣本在80℃條件下反應2分鐘。