[發明專利]吉氏巴貝西蟲重組抗原及其診斷試劑盒和應用

有效

• 申請號: 201210035683.5
• 申請日: 2012-02-16
• 公開（公告）號: CN102558332A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 周金林;楊其清;周勇志;曹杰;張厚雙
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所
• 主分類號: C07K14/44
• 分類號: C07K14/44;C12N15/30;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 上海大邦律師事務所 31252
• 代理人: 周東萍

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種吉氏巴貝西蟲重組抗原及其診斷試劑盒和應用。?

背景技術

吉氏巴貝西蟲(Babesia?gibsoni)是寄生在犬紅細胞中的一種蜱傳原蟲，是犬梨形蟲病(俗稱焦蟲病)的主要病原之一，引起犬發熱、貧血、血紅蛋白尿和消瘦，甚至死亡。目前，吉氏巴貝西蟲病的診斷主要依賴于紅細胞染色鏡檢，但對于紅細胞染蟲率低的非急性感染診斷困難。因此，建立檢測抗體的吉氏巴貝西蟲血清學診斷方法極其重要。早期用蟲體抗原進行血清學診斷，其敏感性和特異性均受到一定限制，近幾年，鑒定蟲體重要抗原分子并應用重組蛋白進行血清學診斷取得較大進展，其中，頂復體分泌蛋白BgTRAP是一個與細胞入侵有關的重要抗原分子，其原核表達的完整重組蛋白顯示了一定的診斷價值。不過BgTRAP全長編碼基因表達產物主要以包涵體形式存在，可溶性蛋白表達量極少，分離純化非常困難，不利于拓展該分子在診斷上的進一步應用。?

發明內容

本發明要解決BgTRAP完整蛋白重組表達產量少、純化困難的技術問題，提供一種吉氏巴貝西蟲重組抗原，該重組抗原包含BgTRAP蛋白TSP1功能區和抗原區的411個氨基酸，是一個可溶性截短型抗原，該截短型抗原不僅能實現高效可溶性表達和分離純化，而且具有良好的抗原性，適于作為犬吉氏巴貝西蟲病的診斷抗原。?

此外，還需要提供一種包含上述吉氏巴貝西蟲重組抗原的診斷試劑盒。?

為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現：?

在本發明的一個方面，提供了一種吉氏巴貝西蟲重組抗原，該重組抗原包含：吉氏巴貝西蟲頂復體分泌蛋白BgTRAP的TSP1功能區和谷氨酸富含區的氨基酸序列，該氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。?

在本發明的另一方面，還提供了一種吉氏巴貝西蟲重組抗原基因，該重組抗原基因包含：編碼吉氏巴貝西蟲BgTRAP蛋白TSP1功能區和谷氨酸富含區氨基酸序列的核苷酸序列，該核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。?

在本發明的另一方面，還提供了一種包含上述吉氏巴貝西蟲重組抗原基因序列的重組載體。?

在本發明的另一方面，還提供了一種包含上述重組載體的宿主細胞。?

在本發明的另一方面，還提供了一種診斷犬吉氏巴貝西蟲病的試劑盒，包含上述吉氏巴貝西蟲重組抗原。?

所述試劑盒還包含ELISA酶標板、酶標二抗、酶底物液，其中酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗犬二抗。?

所述試劑盒還包含對照GST蛋白、陽性對照血清、陰性對照血清，其中陽性對照血清為人工感染吉氏巴貝西蟲的犬血清，陰性對照血清為正常犬血清。?

在本發明的另一方面，還提供了一種檢測犬吉氏巴貝西蟲抗體的方法，包括以下步驟：?

用上述吉氏巴貝西蟲重組抗原包被ELISA酶標板；?

將待測血清與包被重組抗原作用后，依次加入酶標二抗和酶底物液；?

用酶標儀測波長415nm處的OD值，得檢測結果。?

在本發明的另一方面，還提供了一種上述吉氏巴貝西蟲重組抗原在制備診斷犬吉氏巴貝西蟲病的產品中的應用。?

本發明吉氏巴貝西蟲重組抗原，作為ELISA診斷抗原，可明確區分吉氏巴貝西蟲感染犬血清和正常犬血清，而與其他病原感染無交叉反應，顯示其良好的診斷特異性。犬感染吉氏巴貝西蟲系列血清檢測結果表明，本發明吉氏巴貝西蟲重組抗原對感染早期以及慢性感染期均可檢測，表明具有較高敏感性。?

附圖說明

下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。?

圖1是本發明實施例1的BgTRAP蛋白一級結構及截短型抗原蛋白位置示意圖；?

圖2是本發明實施例2的PCR產物的電泳結果圖；?

圖3是本發明實施例2重組tBgTRAP的表達與純化的SDS-PAGE電泳圖；?

圖4是本發明實施例3抗重組蛋白的抗血清與吉氏巴貝西蟲表面熒光反應的激光顯微鏡照片圖；?

圖5是本發明實施例4重組截短型蛋白作為ELISA診斷抗原的特異性試驗結果圖；?

圖6是本發明實施例4檢測感染吉氏巴貝西蟲犬的抗體消長曲線圖。?

具體實施方式

下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規條件，如《精編分子生物學實驗指南》(F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編，馬學軍，舒躍龍的譯.北京：科學出版社，2004)中所述的方法進行。?