[發明專利]一種快速檢測篩選金黃色葡萄球菌的方法

無效

• 申請號: 201210035468.5
• 申請日: 2012-02-16
• 公開（公告）號: CN102590506A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 趙渝;陳艷;顧鳴
• 申請（專利權）人: 上海師范大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 吳瑾瑜

技術領域

本發明涉及微生物食源性致病菌檢測領域，公開了一種以生物功能化超順磁性納米粒子和免疫化的熒光量子點免疫識別目標微生物，實現特異性檢測食源性致病菌金黃色葡萄球菌的方法。

背景技術

隨著生活水平的提高，人們越來越重視食品安全的問題。2003～2004年的統計結果顯示，我國食物中毒致病因素依次為微生物性、化學性、有毒動植物性病原。微生物性病原是導致食物中毒的主要因素，中毒人數最多。因此，快速而準確地檢測與鑒定食品中的病原菌是及時有效控制和預防病原細菌傳播、預防食物中毒的重要前提。

金黃色葡萄球菌是一群常堆積成葡萄串狀，革蘭氏陽性球菌，無芽孢、無鞭毛，不能運動，大多數無莢膜。本菌廣泛分布于自然界，如空氣、土壤、水及其它環境中，是公共場所的一種主要病原菌。金黃色葡萄球菌是污染食品和引起食物中毒的主要病原菌，也是引起化膿性炎性反應、敗血癥及膿毒血癥的病原菌，同時也是檢測醫院消毒效果和醫源性感染的一個重要指標。在歷年食物中毒調查中.該菌占整個細菌性食物中毒的第一位或第二位。

目前，國內檢測食品中金黃色葡萄球菌仍采用傳統的方法，傳統的細菌學培養方法需經富集培養、選擇性分離、形態特征觀察、生理生化反應、血清學鑒定等過程，操作繁瑣復雜、耗時費力，而且無法對人工難以培養的病原菌進行檢測。近年來，隨著生物學技術的迅速發展，出現了很多適合于食源性細菌檢測和分析的分子生物學方法和免疫學方法。這些方法具有操作簡便、快速、靈敏度高和特異性強等特點，通常只需要24～48h就可以獲得檢測結果。常用的免疫學方法主要包括ELISA、免疫膠體金技術等；分子生物學方法則主要有依賴PCR的DNA指紋圖譜技術、多重PCR、基因芯片、定量PCR和實時熒光定量PCR等技術。這些方法雖然提高了檢測的靈敏度，大大縮短了檢測時間，但是都存在一定的缺陷。例如ELISA對試劑的選擇性高，很難同時分析多種成分；對結構類似的化合物有一定程度的交叉反應；分析分子量很小的化合物或很不穩定的化合物有一定的困難。在致病菌的分子生物學檢測方法方面，由于檢樣中存在死的致病菌、特異性DNA或RNA片段存在同源性和檢樣中存在不可培養微生物的情況等問題，常常造成PCR檢測結果與常規方法相比，陽性率變高的現象，除存在不可培養微生物的情況外，均屬于假陽性范疇。

免疫磁性分離技術是將特異性抗體偶聯在磁性顆粒表面，與樣品中被檢致病菌發生特異性的結合，載有致病菌的磁性顆粒在外加磁場的作用下，向磁極方向聚集，棄去檢樣混合液，使致病菌不斷得到分離、濃縮。免疫磁性分離技術代替了常規的選擇性增菌培養過程，可特異有效地將目的微生物從樣品中快速的分離出來。金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)是致病性金黃色葡萄球菌細胞表面一種特有的蛋白質，它具有與人IgG的Fc片段特異性結合的能力，每個SPA分子可以同時結合2個人IgG分子，因此，可用來建立一種致病性金黃色葡萄球菌快速分離檢驗的體系。

為了食品安全，為了尋求更簡便、快速、靈敏的食源性致病菌金黃色葡萄球菌的檢測方法，研發了一種特異性磁性分離熒光標記定性定量檢測金黃色葡萄球菌的方法。

發明內容

本發明旨在提供一種快速檢測篩選金黃色葡萄球菌的方法。

這種快速檢測篩選金黃色葡萄球菌的方法，包括如下步驟：

(1)免疫化的超順磁納米粒子加入到待測樣品，30～40℃混合反應20～60min，使免疫化的超順磁納米粒子與金黃色葡萄球菌發生特異性結合；

(2)在外加磁場吸引作用下，收集免疫化的超順磁納米粒子，用磷酸緩沖液洗滌后加入免疫化的熒光量子點，30～40℃混合反應20～60min，使量子點和吸附在免疫化超順磁納米粒子的致病微生物金黃色葡萄球菌發生特異性結合；

(3)利用外加磁場收集免疫化超順磁納米粒子，用磷酸緩沖液洗滌后定性或定量熒光檢測；

所述的免疫化超順磁納米粒子為表面偶聯人免疫球蛋白IgG的磁性粒子；所述的免疫化熒光量子點為與人免疫球蛋白IgG連接的量子點。

所述免疫化超順磁納米粒子為以四氧化三鐵納米粒子為核心，醛基化修飾，表面偶聯人免疫球蛋白IgG的磁性粒子；所述的免疫化熒光量子點為與人免疫球蛋白IgG連接的量子點。

步驟(2)和(3)所述的外加磁場為2000～6500Gs。

所述的免疫化超順磁性納米磁珠制備方法包括如下步驟：