[發明專利]JAK2 V617F突變的檢測應用

有效

• 申請號: 201210030473.7
• 申請日: 2012-02-10
• 公開（公告）號: CN103243153A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發明（設計）人: 關明;吳之源;張心菊;劉維薇;陳宇明;張偉;萬峻;于波
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬華山醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

本發明屬于核酸檢測領域，具體而言，本發明涉及JAK2基因V617F位點脫氧核糖核酸突變(G1849T)的檢測以及所用的檢測試劑盒和引物對等。

背景技術

Janus?kinase?2(本文簡稱JAK2)屬于Janus激酶家族，為胞內酪氨酸蛋白激酶。JAK2自N-端至C-端共由JH7-JH1共7個高度保守的同源結構域(JH1～JH7)組成，通過作用于EPO、TPO、IL-3、G-CSG、GM-CSF受體，起著調控細胞內信號傳導、產生細胞增殖效應的作用。然而，JAK2基因14外顯子第1849位鳥嘌呤替換為胸腺嘧啶，使位于JAK2蛋白偽激酶區域的第617位苯丙氨酸變異為纈氨酸(JAK2?V617F突變)，將致使偽激酶區域失活，最終導致JAK-STAT、PI3K、AKT等通路出現非細胞因子依賴性激活，從而可能導致骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative?neoplasms，MPN)，包括慢性粒細胞白血病(chronic?myeloid?leukemia，CML)、真性紅細胞增多癥(polycythemia?vera，PV)、原發性血小板增多癥(essential?thrombocythemia，ET)與原發性骨髓纖維化(primary?myelofibrosis，PMF)等。自2008年起，世界衛生組織已在其官方分類診斷標準中將JAK2?V617F突變定義為MPN的分子診斷金標準。(可參見：James?C，Ugo?V，Le?Couédic?JP，Staerk?J，Delhommeau?F，et?al.(2005)A?unique?clonal?JAK2?mutation?leading?to?constitutive?signalling?causes?polycythaemia?vera.Nature?434：1144；Swerdlow?S，Campo?E，Harris?NL，Jaffe?ES，Pileri?SA，et?al.(2008)WHO?Classifcation?of?Tumours?of?Haematopoietic?and?Lymphoid?Tissues.WHO?Classification?of?Tumours.4th?ed.Lyon，France：IARC)

目前檢測該點突變的方法主要是聚合酶鏈式反應(PCR)后進行測序，但是這一方法中的測序耗時且需要的儀器和試劑成本較高，不適合大規模推廣使用。本發明經過長期艱苦的研究，并結合一些篩選的運氣，研究出了一對引物并且研究出了配套的方法，可以通過PCR擴增產物的熔解分析而快速獲得結果，其中無需耗時的步驟，而且熔解分析儀的維護成本比測序儀要低。由于人群的突變基因的比率很低，實踐中一一檢測的效率很低，因此往往用多人的混合樣品進行檢測，更加令人意想不到的是，本發明人研究出來的檢測方法能夠分辨只含1％(甚至更低)的突變型的樣品，而這是測序所無法完成的，因此提高了檢測效率。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于提供新的JAK2?V617F突變的檢測應用，該應用比現有技術更深時、成本更低、和/或更高效。另外，本發明還提供了用于這些應用的試劑盒以及引物對等。

具體而言，在第一方面，本發明提供了檢測JAK2基因的V617F突變的方法，其包括：

(1)對待檢測樣品進行PCR擴增，其中使用的引物對序列為：

5’-TGAAGCAGCAAGTATGATGAG-3’，

5’-GGGAGTATGTGTCTGTGGAGACTGACACCTAGCTGTGATCCTG-3’；和

(2)用熔解分析儀進行熔解分析。

在本文中，待檢測樣品是潛在含有人JAK2基因DNA的離體樣品，包括血液、體液或其提純物。由于人群的突變基因的比率很低，實踐中一一檢測的效率很低，而本發明人發現，本發明第一方面的方法也能適合混合樣品。因此優選在本發明第一方面的方法中，待檢測樣品是來自不同個體的混合樣品。由于是混合樣品，結果只能顯示混合樣品中是否含有突變型基因，但是無法準確判斷其中任何一個個體的樣品是否含有突變型基因，因此不可能針對個體得出診斷結果，而只能針對混合樣品得出檢測結果。優選本發明第一方面的方法由上述(1)和(2)組成，即封閉式的方法。這樣，更加無法得出針對個體得出診斷結果，而只能得出混合樣品中是否含有突變型基因這一非診斷結果。