[發(fā)明專利]間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞活性因子的分離與制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210029310.7
• 申請日: 2012-02-10
• 公開（公告）號: CN103239477A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馮長訪;羅軍蓉
• 申請（專利權(quán)）人: 馮長訪;羅軍蓉
• 主分類號: A61K35/12
• 分類號: A61K35/12;A61K35/30;A61K35/28;A61K35/407;A61K35/44;A61K35/14;A61P39/00;A61P35/00;A61P29/00;A61P3/10
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明專利設(shè)計間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞活性因子的分離與制備方法。通過間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞培養(yǎng)的上清液和培養(yǎng)的干細(xì)胞，將其細(xì)胞破碎，提取間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞中的干細(xì)胞活性因子。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞表達(dá)、合成和分泌的轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)肽、細(xì)胞信號分子、核苷類等生物活性因子，對心臟、肝臟、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)等的修復(fù)與保護(hù)作用；并有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，防止細(xì)胞衰老；干細(xì)胞可通過其表達(dá)、合成和分泌的干細(xì)胞活性分子影響靶器官結(jié)構(gòu)、功能狀態(tài)及其病理狀態(tài)下的修復(fù)，它是實現(xiàn)干細(xì)胞治療改善靶器官功能、抗凋亡、抗癌、抗衰老、抗炎、治療糖尿病等作用的重要功能物質(zhì)。

本發(fā)明提供了間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞表達(dá)、合成和分泌的干細(xì)胞活性因子的分離與制備方法。分離制備的干細(xì)胞活性因子在再生醫(yī)學(xué)(包括惡性腫瘤、心腦血管疾病、免疫性疾病及抗衰老等)和保健品等中具有廣闊的應(yīng)用前景，并將產(chǎn)生重大的社會效益和巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容

分離制備的間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞活性物質(zhì)可分為兩類：小分子干細(xì)胞活性物質(zhì)成為干細(xì)胞活性轉(zhuǎn)移因子。大分子物質(zhì)為大分子干細(xì)胞活性因子。

(一)分離培養(yǎng)干細(xì)胞

1、收獲干細(xì)胞培養(yǎng)的上清液：分離培養(yǎng)干細(xì)胞，用相應(yīng)的培養(yǎng)基和因子培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長到合適階段，收獲上清液；亦可多次傳代，多次收獲。

2、收獲培養(yǎng)的干細(xì)胞：分離培養(yǎng)干細(xì)胞，用相應(yīng)的培養(yǎng)基和因子培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長到合適階段，收獲培養(yǎng)的干細(xì)胞。

(二)干細(xì)胞活性因子的分離制備

1、裂解細(xì)胞、釋放干細(xì)胞活性因子將收獲的干細(xì)胞加合適的液體，并調(diào)節(jié)到合適的pH值，采用機(jī)械(超聲波、膠體磨等)或物理(如多次凍融等)學(xué)方法裂解破壞細(xì)胞，使其釋放細(xì)胞內(nèi)干細(xì)胞活性因子。

干細(xì)胞培養(yǎng)上清液不需裂解程序，可直接按下面方法分離提取干細(xì)胞活性因子。

2、分離提取干細(xì)胞活性因子

可用以下方法：

(1)透析提取小分子干細(xì)胞活性因子(相似于干細(xì)胞活性轉(zhuǎn)移因子)

將上述干細(xì)胞裂解物，經(jīng)適當(dāng)處理后，裝入透析袋或玻璃紙透析裝置內(nèi)，在一定溫度下透析，12-30小時收取透析液。

(2)中空纖維柱分離提取干細(xì)胞活性因子

將上述干細(xì)胞裂解物，經(jīng)適當(dāng)處理后，用適當(dāng)分子截留孔徑(如0.2KD、5KD、10KD、15KD等)的中空纖維柱分離截取干細(xì)胞活性因子，按分子量不同，小分子物質(zhì)為干細(xì)胞活性轉(zhuǎn)移因子，大分子物質(zhì)為大分子干細(xì)胞活性因子。

(3)離子交換和層析提取干細(xì)胞活性因子

采用離子交換和層析分離提取干細(xì)胞活性因子，根據(jù)干細(xì)胞的分子量或親和性分步(或特定)收集干細(xì)胞活性因子。

3、干細(xì)胞活性因子的鑒定

(1)蛋白質(zhì)濃度的鑒定。

(2)核糖和多核苷酸的濃度鑒定。

(3)蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)的分類鑒定。

(4)干細(xì)胞活性因子的生物活性鑒定。

4、可形成的干細(xì)胞活性因子制劑

(1)注射用制劑。

(2)口服制劑。

(3)噴霧制劑。

(4)外用制劑。

附圖說明

無

具體實施方式

下面通過四個實例描述本發(fā)明所涉及的提取干細(xì)胞活性因子的方法，但本發(fā)明所涉及的范圍并不局限于本四個實例。

實施例一：用透析袋或玻璃紙制備干細(xì)胞小分子活性因子(類似轉(zhuǎn)移因子)

1、細(xì)胞分離：從胎兒骨髓、肝、脾、臍帶；嬰兒臍帶；人骨髓、外周血液；人脂肪組織等分離干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，用專門配制的或購買的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞干細(xì)胞。

2、細(xì)胞檢定：經(jīng)流式細(xì)胞儀檢定細(xì)胞表面標(biāo)志和生物芯片檢定其表面標(biāo)志、生長因子和細(xì)胞因子等。

3、細(xì)胞和細(xì)胞分泌液的收獲：

(1)收獲細(xì)胞分泌液：直接收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液，然后進(jìn)行分離純化。

(2)收獲干細(xì)胞：將培養(yǎng)一定時間的干細(xì)胞，2000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，上清液為細(xì)胞分泌液；細(xì)胞用注射用水懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度，用醋酸緩沖液調(diào)pH3.5-7.0。

(3)破碎細(xì)胞：將懸浮的細(xì)胞置于-20℃冷凍，水浴解凍，連續(xù)凍容3次，顯微鏡下觀察細(xì)胞凍容情況，如還有較多的完整細(xì)胞，可增加凍融次數(shù)。