[發明專利]一種產甜葉菊糖基轉移酶UGT76G1的基因工程菌及其應用

無效

• 申請號: 201210029158.2
• 申請日: 2012-02-09
• 公開（公告）號: CN102559528A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 嚴明;李艷;劉歡;許琳;郝寧;魏淼;許昇;安明東;王珊珊;安芳芳;郝思清;顧金海
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/54;C12N15/63;C12N9/10;C12P19/56;C12R1/865
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術領域

本發明涉及一種產甜葉菊糖基轉移酶UGT76G1的基因工程菌及其應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

甜味劑是食品工業中最廣泛的添加劑，按其來源分為天然甜味劑和人工合成甜味劑。在天然甜味劑中，應用最多的是蔗糖，但蔗糖是一種高熱量的甜味劑，攝入過多會導致人體肥胖、糖尿病、齲齒等疾病的發牛^{[1，2，3，4]}。人工合成的甜味劑，如甜精(dulin，對-乙氧基苯脲)、環己氨基磺酸鹽(cyclamata)，雖然可以使人們對甜味得到滿足，但相繼被發現有毒副作用而被禁用；糖精(saccharin，鄰磺酰苯甲酰亞胺)，也因被報道有致癌作用而可能被限制使用。尋找無毒、安全、低熱能、高甜度的天然甜味劑一直是科學研究的熱點。

甜葉菊(Stevia?rebaudiana?bertoni)，又名甜菊、糖草，是原產于南美巴拉圭等地的一種野生菊科草本植物，它是目前已知甜度較高的糖料植物之一^[5]。甜菊糖(Steviol?glycosides)是從甜葉菊的葉、莖中提取出的一種新型天然甜味劑。它具有高甜度、低熱能的特點，其甜度是蔗糖的150～300倍，熱值僅為蔗糖的1/300^[6]。經大量藥物實驗證明，甜菊糖無毒副作用，無致癌物，食用安全，經常食用可預防高血壓、糖尿病、肥胖癥、心臟病、齲齒等病癥^{[7，8，9]}，是一種可替代蔗糖非常理想的甜味劑。甜菊糖可廣泛應用于食品、飲料、醫藥、日用化工、釀酒、化妝品等行業^[11]，并且較應用蔗糖可節省成本60％。甜菊糖是目前世界已發現并經我國衛生部、輕工業部批準使用的最接近蔗糖口味的天然低熱值甜味劑^[10]。是繼苷蔗、甜菜糖之外第三種有開發價值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被國際上譽為“世界第三糖源”。

甜菊葉中三種最主要的糖甙成分在葉片中的含量通常為：甜菊甙(stevioside，stevioside)占葉片干重9.1％，萊鮑迪甙A(rebaudioside?A，rebaudioside?A甙)占3.8％，萊鮑迪甙C(rebaudioside?C，RC甙)占0.6％^[12]。市售甜菊糖一般以stevioside為主要成分，該組分甜度為蔗糖的200倍左右，其后味略帶甘苦味。而作為甜菊糖的第二主成分，rebaudioside?A甙甜度為蔗糖400倍，口味純正，沒有后苦味。因此，提高rebaudioside?A甙相對含量是提高甜菊糖品質的關鍵步驟。

目前文獻報道提高rebaudioside?A甙相對含量的策略有：(1)培育rebaudioside?A甙高含量的甜菊品種，國內已經嘗試成功通過嫁接方法，獲得rebaudioside?A甙含量超過40％品種，但該品種不具備普適性，且品種容易退化，不適宜大面積種植^[11]；(2)通過純化提高rebaudioside?A甙與stevioside的比例，此法由于天然植物中rebaudioside?A甙含量低于stevioside，且二者物理性質極為相近，使得純化工藝難度很大，得率較低。這兩種方法的高成本造成目前市場上高rebaudioside?A甙含量的甜菊糖價格很高，含80％rebaudioside?A甙的甜菊糖市價比一般混合型甜菊糖要高出4～5倍。另有報道，可以利用環糊精糖基轉移酶修飾法改進甜菊糖的口感和味質，但是該法嚴重降低甜度，因此也不是最佳的解決方案?？傊?，目前已有的方法都不適宜推廣。因此，尋求高效的生物酶法轉化途徑已經成為提高rebaudioside?A甙相對含量的必然趨勢。

糖基轉移酶UGT76G1作為植物糖基轉移酶家族的一員，可以特異性的催化甜葉菊中的stevioside，生成rebaudioside?A甙，因此有著重要的研究價值。Richman等從甜葉菊的EST中分離了3種UGTs基因^[13]，UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1。體外活性分析表明，UGT85C2催化甜菊醇到甜菊單甙(steviolmonoside)的反應，UGT74G1主要催化甜菊雙甙(steviolbioside)的糖基化反應，產生stevioside。而stevioside到rebaudiosideA甙由UGT76G1一步糖基化反應完成，見圖1。Humphrey等人的實驗結果也證實了此過程^[14]。