[發(fā)明專利]從表達(dá)腺病毒E1A蛋白的細(xì)胞中獲得唾液酸化增加的重組蛋白質(zhì)的方法及由此獲得的蛋白質(zhì)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210019804.7
• 申請日: 2005-12-28
• 公開（公告）號: CN102653772A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: D·J·E·奧普斯泰爾滕
• 申請（專利權(quán)）人: 克魯塞爾荷蘭公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 永新專利商標(biāo)代理有限公司 72002
• 代理人: 王健

本申請是申請日為2005年12月18日的申請?zhí)枮?00580045170.0標(biāo)題為“從表達(dá)腺病毒E1A蛋白的細(xì)胞中獲得唾液酸化增加的重組蛋白質(zhì)的方法及由此獲得的蛋白質(zhì)”的申請的分案申請

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)領(lǐng)域，特別涉及重組蛋白質(zhì)如紅細(xì)胞生成素的糖基化，更特別涉及當(dāng)在表達(dá)腺病毒E1A的細(xì)胞中生產(chǎn)時重組蛋白質(zhì)的糖基化。

發(fā)明背景

如WO?00/63403所示，表達(dá)至少腺病毒E1A蛋白的永生化人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞可適用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。

在表達(dá)腺病毒E1A的細(xì)胞中產(chǎn)生的具有N聯(lián)糖基化的重組蛋白質(zhì)具有特異性糖基化模式，例如特征在于存在Lewis-X結(jié)構(gòu)，如WO03/038100所述。

在表達(dá)E1A的細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的另一特征是呈現(xiàn)相對低的半乳糖基化及低唾液酸化的N聯(lián)聚糖(WO?03/038100)。對于某些目的，這可能是有益的，但對于其它目的，較高水平的半乳糖基化及優(yōu)選同時唾液酸化是有益的。

例如，在表達(dá)E1A的細(xì)胞中產(chǎn)生的紅細(xì)胞生成素(EPO)具有顯著量的Lewis-X結(jié)構(gòu)和在N聯(lián)聚糖中相對低百分比的半乳糖基化和唾液酸化(WO?03/038100)，產(chǎn)生非常適于治療缺血/再灌注損傷但不太適合治療貧血的分子。對于治療貧血，已經(jīng)確定EPO的高度唾液酸化有益于增加治療對象血清中EPO的半衰期，由此延長該物質(zhì)處于活性的時間而增加紅細(xì)胞計數(shù)(Goldwasser?et?al.，1974)。

因此，對于治療缺血/再灌注損傷，在表達(dá)E1A的細(xì)胞中表達(dá)EPO對于為此用途產(chǎn)生的EPO的優(yōu)選糖基化模式具有潛在益處。然而，對于EPO的其它應(yīng)用，不同的糖基化模式可能是有益的。

對于其它蛋白質(zhì)可存在類似情況，即對于某些應(yīng)用，基于在表達(dá)E1A的細(xì)胞中表達(dá)而觀察到的特定糖基化模式可能是高度有益的，而對于其它目的，不同的糖基化模式也許更適合。

已經(jīng)對于其它細(xì)胞類型描述了在細(xì)胞中過表達(dá)唾液酸轉(zhuǎn)移酶以增加在該細(xì)胞中產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)的唾液酸化(例如Grabenhorst?et?al.，1995；Minch?et?al，1995；Jenkins?et?al，1998；Zhang?et?al，1998；Weikert?et?al，1999；Fukuta?et?al.，2000；Prati?et?al.，2000)。然而考慮到糖基化的復(fù)雜性及仍未清楚E1A在其中的作用(WO?03/038100)，從前還未知這種方案是否在表達(dá)E1A的細(xì)胞中產(chǎn)生所期望的結(jié)果。特別地，在表達(dá)E1A的細(xì)胞中糖基化過程中不同糖基化轉(zhuǎn)移酶與其它參與者之間的相互影響和潛在競爭使得尚無法預(yù)料及不可預(yù)知唾液酸轉(zhuǎn)移酶在這種細(xì)胞中的過表達(dá)對因此產(chǎn)生的蛋白質(zhì)糖基化模式方面的結(jié)果。

為了拓寬在表達(dá)E1A的細(xì)胞中產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)的潛在應(yīng)用范圍，增加這種蛋白質(zhì)的半乳糖基化和唾液酸化是有益的。本發(fā)明的一個目的是提供實現(xiàn)這個目的的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及提供得自表達(dá)E1A的細(xì)胞的新的紅細(xì)胞生成素組合物。

本發(fā)明的另一目的是提供降低在細(xì)胞例如表達(dá)腺病毒E1A的細(xì)胞中重組表達(dá)的蛋白質(zhì)上LacdiNAc結(jié)構(gòu)的平均含量的方法。

附圖簡述

圖1.通過對商購EPO(EPREX^TM，泳道A)、在PER.C6-EPO-ST克隆25-3.10中產(chǎn)生的EPO(泳道B)及在PER.C6-EPO克隆25中產(chǎn)生的EPO(泳道C)進(jìn)行等電聚焦確定的唾液酸含量。圖中也示出了每個EPO分子推定的唾液酸數(shù)目。

圖2.在DMEM中，貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物(A)及在無血清培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物(B)中產(chǎn)生的PER.C6-EPO的去唾液酸化N聯(lián)糖的MALDI-MS譜。

圖3.對在VPRO培養(yǎng)基中無血清懸浮培養(yǎng)物中不過表達(dá)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的PER.C6細(xì)胞中產(chǎn)生的EPO(泳道1)、在VPRO中無血清懸浮培養(yǎng)物中過表達(dá)α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的PER.C6細(xì)胞(即PER.C6-EPO-ST克隆25-3.10)中產(chǎn)生的EPO(泳道2)及商購的EPO即EPREX^TM(泳道3)通過等電聚焦確定的唾液酸含量。