[發(fā)明專利]沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物在制備防治炎癥性腸病藥物中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210018080.4
• 申請日: 2012-01-19
• 公開（公告）號: CN102861317A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張成崗;徐陽;吳永紅;李偉光;李軍懷;張艷春;高艷;李志慧
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所;蘇州科景生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: A61K38/16
• 分類號: A61K38/16;A61P1/00;A61P1/04;A61P29/00
• 代理公司: 北京尚誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域中重組蛋白在藥物研發(fā)中的新用途，特別是涉及一種沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物(代號CZLC331)在研制用于防治炎癥性腸病藥物中的新用途。

背景技術(shù)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative?Colitis，UC)又稱特發(fā)性潰瘍性結(jié)腸炎或慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎，是一種以粘膜及粘膜下層浸潤為主、特發(fā)于大腸的慢性非特異性炎癥性腸病，主要臨床癥狀表現(xiàn)為：腹痛、腹瀉、粘液便和血便，并伴有多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)炎和骨質(zhì)疏松等病癥。由于該病具有治療難度大、療程長及易復(fù)發(fā)等特點，已被世界衛(wèi)生組織確定為現(xiàn)代難治病。雖然現(xiàn)已有多種炎癥性腸病治療藥物，如氨基水楊酸類藥物、糖皮質(zhì)激素類藥物和免疫抑制劑等，但是它們卻具有療效差(尤其是中重度UC)、起效慢、療程長、副作用大等缺點，因此，市場上迫切需要一種療效顯著、起效快、療程短、安全性高、副作用小、用藥方便的預(yù)防和治療炎癥性腸病(特別是慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎)的藥物。

關(guān)于沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物，已有研究表明，沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CBLB502(標(biāo)準(zhǔn)命名)對造血系統(tǒng)有保護(hù)作用，可延長高劑量放射損傷后小鼠的生存時間，并可提高低劑量照射小鼠的生存率(Lyudmila?G.Burdelya，et?al，.An?Agonist?ofToll-Like?Receptor?5?Has?Radioprotective?Activity?in?Mouse?and?Primate?Models.Science?2008；320(5873)：226-230)。深入研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌鞭毛蛋白及包含其N-和C-端保守結(jié)構(gòu)域的衍生物均具有輻射防護(hù)作用，能夠有效提高小鼠骨髓中造血干細(xì)胞數(shù)量有效地預(yù)防致死劑量照射引起的小鼠死亡，其機制為通過NF-κB信號通路發(fā)揮抗凋亡作用。提示該沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CBLB502可向抗輻射藥物方向發(fā)展。目前并沒有任何關(guān)于沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物向抗輻射藥物以外其它藥用方向的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331在防治炎癥性腸病藥物研發(fā)與制備中的用途。

本發(fā)明所述沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331對炎癥性腸道疾病如潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病等具有良好的預(yù)防和治療效果，因此，以該蛋白為活性成分，可以制備成預(yù)防和治療炎癥性腸病的藥物。

本發(fā)明所述沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331是包括Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽、沙門氏菌鞭毛蛋白自N端第1-176位氨基酸殘基和第402-505位氨基酸殘基的融合蛋白；所述沙門氏菌鞭毛蛋白自N端第1-176位氨基酸殘基和第402-505位氨基酸殘基可通過柔性連接肽連接。

可采用常規(guī)原核表達(dá)方法制備沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331，純度大于95％。

具體制備沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331的方法可包括以下步驟：

1)合成沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296編碼基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示；所述沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296是通過柔性臂將沙門氏菌鞭毛蛋白自N端第1-176位氨基酸殘基和自N端第402-505位氨基酸殘基連接得到的；

2)將人工合成的沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296編碼基因克隆到攜帶Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)肽編碼序列的原核表達(dá)載體中，得到攜帶Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽編碼序列和沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296編碼基因的原核表達(dá)載體；所述N端連接有Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物命名為CZLC331，編碼該蛋白的基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；

3)將重組表達(dá)載體pET28b-Tat-CZLC331轉(zhuǎn)化入宿主菌；

4)誘導(dǎo)表達(dá)含有攜帶Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽編碼序列和沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296基因的原核表達(dá)載體的宿主菌；

5)分離及純化表達(dá)的重組蛋白，得到沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白。

在上述沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331制備方法中，所述步驟2)中攜帶Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)肽編碼序列的原核表達(dá)載體為任意一種可在大腸桿菌中表達(dá)的原核表達(dá)載體，如pET-22b系列、pET-28系列或pET-15系列等，優(yōu)選為pET28b-Tat；以pET28b-Tat為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331編碼基因的重組表達(dá)載體為pET28b-Tat-CZLC331。