[發(fā)明專利]一種天然抗氧化肽Rotodorin-D1及其制備方法和應(yīng)用無(wú)效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201210014119.5 | 申請(qǐng)日： | 2012-01-17 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN102584950A | 公開(kāi)（公告）日： | 2012-07-18 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 梁醒財(cái) | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 梁醒財(cái) |
| 主分類號(hào)： | C07K7/08 | 分類號(hào)： | C07K7/08;C07K1/16;A61K8/64;A61Q19/08 |
| 代理公司： | 昆明正原專利代理有限責(zé)任公司 53100 | 代理人： | 金耀生 |
| 地址： | 650224 云南省昆明市盤龍*** | 國(guó)省代碼： | 云南;53 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說(shuō)明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 天然 氧化 rotodorin d1 及其 制備 方法 應(yīng)用 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種具有抗氧化活性的多肽--天然抗氧化肽Rotodorin-D1及其制備方法和在化妝品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
自由基是機(jī)體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物，具有強(qiáng)氧化性，可損害機(jī)體的組織和細(xì)胞，進(jìn)而引起慢性疾病及衰老效應(yīng)。在正常生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，但當(dāng)機(jī)體處于不良環(huán)境狀態(tài)下，以及隨著年齡的增長(zhǎng)，體內(nèi)的自由基將會(huì)產(chǎn)生過(guò)多或清除過(guò)慢。自由基清除劑也稱為抗氧化劑，可清除體內(nèi)多余的自由基，減輕它們對(duì)機(jī)體的損傷。
目前，一直公認(rèn)的自然界生物體中存在著2套抗氧化系統(tǒng)，第一套是蛋白質(zhì)大分子，比如SOD；第二套為有機(jī)小分子，比如Vc、BHT等?；瘜W(xué)合成的抗氧化劑如BHA、BHT等，本身具有毒、副作用，各國(guó)政府紛紛對(duì)其強(qiáng)制規(guī)定了ADI值，控制其過(guò)量添加。化妝品中常見(jiàn)的抗氧化劑，如維生素C、維生素E及SOD等，其氧化活性又有限。而天然蝦青素之類的天然抗氧化劑的添加產(chǎn)品，由于其賣點(diǎn)為“天然”，售價(jià)普遍過(guò)高，難以為大眾所接受。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種天然抗氧化肽Rotodorin-D1及其制備方法和在化妝品中的應(yīng)用，用中國(guó)特有臭蛙的皮膚中存在的天然抗氧化肽替代傳統(tǒng)的抗氧化劑，開(kāi)發(fā)新一代天然，極低毒、高效的抗氧化類化妝品。
隨著多肽組學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，本發(fā)明在青蛙皮膚中發(fā)現(xiàn)了第三套抗氧化系統(tǒng)，其由基因編碼的多肽構(gòu)成，這種多肽多由10-20個(gè)氨基酸殘基組成。這種天然抗氧化肽是高原地區(qū)兩棲動(dòng)物的皮膚對(duì)抗紫外損傷有效而強(qiáng)大的武器，對(duì)其生存是至關(guān)重要的，且其來(lái)源天然，低毒、高效的特性，更符合現(xiàn)代人對(duì)化妝品的要求。
本發(fā)明所獲得的天然抗氧化肽來(lái)源于中國(guó)特有的臭蛙(Odorrana?andersonii)的皮膚分泌物。蛙類，是動(dòng)物從水生生活到陸生生活的重要過(guò)渡類型，其皮膚裸露，富含腺體，能分泌大量的活性物質(zhì)，包括抗菌肽、激肽、鎮(zhèn)痛肽等，其中還有大量未知功能的多肽。臭蛙是蛙類動(dòng)物的“祖先”，因其皮膚在受刺激時(shí)能分泌具有刺激性氣味的混合物而得名。根據(jù)以往工作的經(jīng)驗(yàn)顯示，選取祖先種提取到的有效成分，其活性較強(qiáng)，本發(fā)明選用了蛙類的祖先云南臭蛙，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合預(yù)期的推測(cè)。
本發(fā)明的天然抗氧化肽Rotodorin-D1按以下方法制備：
①皮膚分泌物的獲取：用6V的電壓刺激云南臭蛙的皮膚6s，之后以25mM?Tris-HCl緩沖液(pH＝7.8)清洗臭蛙的身體，收集皮膚分泌物，將收集到的分泌物于4000rpm離心15min，將上清液真空冷凍干燥，并儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆茫?/p>
②多肽的純化：將凍干的上清液樣品重新溶解，上預(yù)先用25mM?Tris-HCl緩沖液(pH＝7.8，含有0.1M?NaCl)平衡好的Sephadex?G-75凝膠過(guò)濾柱，以0.3ml/min的流速進(jìn)行洗脫，每10min收集一次。洗脫產(chǎn)物用280nm監(jiān)測(cè)，繪制分離純化圖譜，收集到抗氧化活性成分，并用C4柱除去里面的鹽分后冷凍真空干燥。之后，用20mM的NaAc-HAc緩沖液(pH＝4.0)溶解樣品，用相同緩沖液平衡好的Resource?S分離柱進(jìn)行純化，利用含有1M?NaCl的同一緩沖液、以1ml/min的流速進(jìn)行洗脫，洗脫液用215nm波長(zhǎng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，收集到具有抗氧化活性的成分，之后用含0.1％(v/v)TFA的超純水平衡好的HPLC?C18分離柱進(jìn)行分離，利用含有0.1％(v/v)TFA的乙腈以0.7ml/min的流速洗脫，洗脫液在215nm下進(jìn)行監(jiān)測(cè)，最終獲取天然抗氧化肽Rotodorin-D1純品。
抗氧化活性評(píng)估：樣品抗氧化活性的評(píng)估反映在其對(duì)自由基的清除率上，具體如下：首先配置ABTS儲(chǔ)存液：在水溶液溶解2.8mM過(guò)硫酸鉀和7mM?ABTS，避光反應(yīng)至少6小時(shí)，之后，立即用水稀釋125倍，50微升溶于水的樣品加入50微升ABTS稀釋液，避光反應(yīng)至少10分鐘，之后，在415nm波長(zhǎng)下讀其吸光度，樣品抗氧化活性用如下公式進(jìn)行計(jì)算：(Ablank-Asample)×100/Ablank。
經(jīng)上述方法制備得到天然抗氧化肽Rotodorin-D1，其為基因編碼產(chǎn)物。N端到C端的序列：KSSDVKYYLAKCTTDVQ。活性：1ug/ml的濃度下即可清除20％的自由基，具有一定的殺菌、免疫調(diào)節(jié)以及水平衡調(diào)節(jié)的活性。
產(chǎn)品主要技術(shù)指標(biāo)：抗氧化肽的活性評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)是能發(fā)揮作用的最小濃度(ug/ml或umol/ml)。
該專利技術(shù)資料僅供研究查看技術(shù)是否侵權(quán)等信息，商用須獲得專利權(quán)人授權(quán)。該專利全部權(quán)利屬于梁醒財(cái)，未經(jīng)梁醒財(cái)許可，擅自商用是侵權(quán)行為。如果您想購(gòu)買此專利、獲得商業(yè)授權(quán)和技術(shù)合作，請(qǐng)聯(lián)系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/201210014119.5/2.html，轉(zhuǎn)載請(qǐng)聲明來(lái)源鉆瓜專利網(wǎng)。
