[發明專利]用于兔子皮膚移植后免疫狀態監測的試劑及其制備方法

無效

• 申請號: 201210013937.3
• 申請日: 2012-01-17
• 公開（公告）號: CN102580119A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 蔣澤生;高毅;潘明新;鐘利民
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學珠江醫院
• 主分類號: A61K49/00
• 分類號: A61K49/00
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

技術領域

本發明涉及醫用配置品，具體涉及用于兔子皮膚移植后免疫狀態監測的試劑及其制備方法。?

背景技術

器官移植后必需應用免疫抑制劑防止急性排斥反應的發生，免疫抑制劑通過抑制T細胞和B細胞等靶細胞的細胞增殖、細胞因子合成而起作用。但是目前仍然無法區分移植抗原引起的免疫排斥反應和病毒細菌感染引起的免疫反應。理想的免疫抑制治療應該在免疫抑制和保持免疫力間取得平衡，因此對于臨床醫生來說移植患者管理是一件很困難的事。保存受體免疫力，盡可能減小免疫抑制劑用量或誘導免疫耐受一直是移植免疫學家的主要目標，因此移植后免疫監測至關重要。?

目前臨床常用受體免疫狀態的監測的方式仍然是臨床癥狀評估結合移植物活檢。但是，活組織病理檢查對移植物和宿主均是一種損傷性檢查，不能重復進行，不能完全反應移植器官的免疫狀態，而且當病理檢查已出現排斥反應時，移植排斥已經發生，因此病理檢查有其固有的局限性。?

除了病理檢查，常用的免疫監測方法有：外周血T細胞計數、殺傷細胞CTL和NK細胞活性測定、MHC分子檢測、細胞因子測定、Perforin、顆粒酶B?、CD40L和FasL的測定、循環抗體檢測等。?

由于免疫反應的復雜性，上述免疫學檢測方法的均有其局限性，依靠單一免疫指標來評估機體的免疫狀態不太現實，臨床上衡量器官移植后排斥反應及免疫抑制治療的效能主要通過排斥反應的發生情況（病理活檢）和移植物功能情況，如腎移植時肝腎毒性的發生情況，肝移植時肝功能情況（血Cr、ALT等）來進行評估。病理診斷目前仍然是診斷排斥反應的金標準，但是移植物活組織病理檢查也有其局限性：一、活檢組織檢測是一種損傷性檢查方法，對移植物的正常存活有一定的影響，不能反復采取樣本，另外，采取樣本過少又會影響病理切片讀片的正確性；二、活檢組織病理學檢查是非定量性指標，影響其臨床診斷的準確性，病理學檢查容易受讀片者的主觀因素及技術水平的影響，產生偏倚，缺乏客觀性；三、病理切片檢查無法對浸潤性淋巴細胞做功能性評判，不利于排斥反應的早期診斷．在排斥反應發生的早期或移植物失功能的受者，甚至臨床上表現為穩定型的受者，病理活檢切片都可看到大量T淋巴細胞浸潤，或僅表現為斑點性T細胞浸潤。?

發明內容

本發明的目的在于提供用于兔子皮膚移植后免疫狀態監測的試劑及其制備方法。?

本發明所采取的技術方案為：?

用于兔子皮膚移植后免疫狀態監測的試劑，該試劑是經CFSE染色的兩種同品系的兔脾細胞的PBS懸液，兩種兔脾細胞的總濃度為（5～7）×10⁷個/mL，二者的比例為1：1，其中，兩種兔脾細胞分別來自經過異體皮膚移植后的供體和受體，染色后的陽性細胞比例≥95%，活細胞比例≥95%。

優選的，供體為雌性兔子。?

優選的，受體為雄性兔子。?

上述的用于兔子皮膚移植后免疫狀態監測的試劑的制備方法，包括如下步驟：?

1)??????取同品系的雌性兔子和雄性兔子分別為供體和受體，進行異體皮膚移植；?

2)??????異體皮膚移植后第10～13天切除供體和受體的脾臟，分別制成供體脾細胞的PBS懸液和受體脾細胞的PBS懸液；

3)??????往供體脾細胞的PBS懸液中加入6μM?CFSE，往受體脾細胞的PBS懸液中加入0.24μM?CFSE，然后在溫度為37℃下孵育染色；

4)??????染色后，將供體脾細胞和受體脾細胞用PBS洗滌后，按細胞數1∶1?的比例混合，用PBS調整細胞總濃度為（5～7）×10⁷個/mL，得用于兔子皮膚移植后免疫狀態監測的試劑。

優選的，雌性兔子為雌性大白兔。?

優選的，雄性兔子為雄性大白兔。?

優選的，孵育染色時間為15～20?min。?

本發明中所述的CFSE為羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯。?

本發明所述的細胞來源于經過異體皮膚移植后的供體和受體的脾細胞，供體細胞與移植物同基因，抗原性與移植物完全相同，能被因移植產生的免疫反應特異性殺傷，全面、準確地反映移植物所受的免疫攻擊；受體細胞與進行皮膚移植的兔同基因，作為免疫狀態監測的內參，用于消除由于細胞破碎、死亡、歸巢等一系列細胞在體外染色處理及體內自然死亡等非特異生損失帶來的誤差。?