[發(fā)明專利]一種檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法

有效

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• 申請日: 2012-01-13
• 公開（公告）號: CN102534006A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設計）人: 胡曉湘;田明;李寧
• 申請（專利權）人: 中國農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發(fā)明涉及分子標記檢測技術，具體地說，涉及一種檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法。

背景技術

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，外貌特征在雞的育種和保種中占據(jù)重要地位，分子標記也在育種和保種中起到了重要作用。但是對于控制外貌特征的分子標記的研究仍然較少，僅有少量的外貌特征能夠通過分子標記進行輔助選擇育種。

烏骨雞作為中國特有雞種，具有烏皮、烏骨、烏肉等“十全”特征。其中烏骨雞的黑色特征主要受到纖維黑色素基因(Fm⁺/fm^-)的影響。烏骨雞的結締組織呈黑色(Kuklenski，1915)，雞冠、肉髯呈深紫色，耳朵、腳脛及喙呈藍色。攜帶Fm基因的雞種中，黑色素出現(xiàn)的部位包括肌膜、神經(jīng)、肌腱、血管、性腺、腸系膜、骨膜與皮膚真皮層等。出于對烏骨雞“烏色”的重視，中國利用烏骨雞的骨頭與肌肉作為傳統(tǒng)中藥的引藥，一些攜帶Fm基因的改良雞種，飼養(yǎng)至12-14周齡作為傳統(tǒng)料理的食材。

Fm基因控制的黑色表型相對于fm基因控制的非黑色表型是一種單位點控制的顯性性狀，因而在保種和育種的過程中，根據(jù)表型無法準確區(qū)分顯性純合子和雜合子個體，造成選育效率低下。隨著分子數(shù)量遺傳理論的發(fā)展，需找到影響真皮層黑色性狀的分子標記，通過標記輔助選擇，可以迅速準確地鑒定候選個體的基因型，從根本上解決這一保種和育種問題。

DNA分子標記是以個體間遺傳物質(zhì)中的核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映。在雞基因組中分布有大量的分子標記，攜帶巨大的遺傳信息量，目前已經(jīng)有多個重要性狀得到了定位，可以利用相關的分子標記進行分子標記輔助選擇育種，對育種起到了巨大的促進作用。

單核苷酸多態(tài)性(single?nucleotide?polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，是一種十分理想、有效的分子標記。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法，其是對烏骨雞第20號染色體位于10739109bp位點(基于雞基因組序列信息版本號WUGSC?2.1/galGal3，2006年5月)的核苷酸進行單核苷酸多態(tài)性檢測，根據(jù)檢測結果判定烏骨雞的纖維黑色素基因為純合或雜合。單核苷酸多態(tài)性檢測優(yōu)選采用的方法為焦磷酸測序。

本發(fā)明還檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的引物，包括F：5′-GCCCCTTCCTGAAGCAATA-3′和R：5′-CATGCAGGATCTCTATGAAGAAAA-3′。

本發(fā)明還提供檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的探針，其核苷酸序列為5′-GTATTCTAGAAGCCATTCC-3′。

本發(fā)明還提供含有上述引物及探針的檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的試劑盒。

本發(fā)明進一步提供一種檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法，其是以烏骨雞的基因組DNA為模板，采用上述引物進行PCR擴增，然后用上述探針對擴增產(chǎn)物進行單核苷酸多態(tài)性檢測，根據(jù)檢測結果判定烏骨雞的纖維黑色素基因為純合或雜合；其中，單核苷酸多態(tài)性檢測是針對第20號染色體位于10739109bp位點的核苷酸。

PCR反應體系為：基因組DNA?30ng，1x擴增緩沖液，Mg²⁺50mM，dNTPs?5mM，引物F?10μM，引物R?10μM，Taq?DNA聚合酶1U，加水補至25μl。

PCR反應條件為：95℃變性5min；95℃變性15sec，57℃退火30sec，72℃延伸30sec，共45循環(huán)；72℃延伸7min；20℃保存。

檢測待測雞第20號染色體位于10739109bp位點的基因型是AG還是GG(A為腺嘌呤核苷酸，G為鳥嘧啶核苷酸)；當基因型是AG時，A∶G＝1∶1，則表示該位點在兩條染色體上都存在CNV(基因拷貝數(shù)變異)，每條染色體上都有一個拷貝的基因型是AA，一個拷貝的基因型是GG，待測雞為Fm黑色顯性純合；A∶G＝1∶2時，則表示該位點只在一條染色體上存在CNV，一個拷貝的基因型是AA，一個拷貝的基因型是GG，另一條染色體上不存在CNV，只有一個拷貝，基因型是GG，待測雞為Fm黑色顯性雜合；如果待測雞的基因型為GG，則表示該位點在兩條染色體上都不存在CNV，每條染色體上都只有一個拷貝，基因型是GG，待測雞為fm非黑色隱性純合。