[發明專利]一種玉米醇溶蛋白基因RNAi載體

無效

• 申請號: 201210010543.2
• 申請日: 2012-01-14
• 公開（公告）號: CN102517314A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 陳威;番興明;劉麗;王琨
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院糧食作物研究所;云南田瑞種業有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 昆明合眾智信知識產權事務所 53113
• 代理人: 康珉

1.一種玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD是在骨架載體pUC19上含有胚乳特異表達啟動子P-zp22/6，胚乳特異表達啟動子P-zp22/6位于所述的RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的酶切位點SacⅠ和SmaⅠ間；正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P位于所述的RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的酶切位點SmaⅠ和XbaⅠ間；反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P位于所述的RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的酶切位點XbaⅠ和XhoⅠ間；在正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P之間含有GUS基因內含子，?GUS基因內含子位于所述的RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的XbaⅠ酶切位點間；終止子poly(A)位于所述的RNAi載體pUC19-RNAi-22KD酶切位點HindⅢ和XhoⅠ間；所述的胚乳特異表達啟動子P-zp22/6的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示，所述22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P?的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:8所示，所述GUS基因內含子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:14所示，所述終止子poly(A)的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:11所示，所述玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:15所示。

2.根據權利要求1所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD，其特征在于：所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD按以下方法構建獲得：

（1）構建含有胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的重組載體pUC19-p22/6?

①胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的獲得

以玉米品種的基因組DNA為模板，以SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示序列的特異啟動子p引物對進行PCR擴增，得到如SEQ?ID?NO:3所示序列的胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6；

②構建含有胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的重組載體pUC19-p22/6

用SacⅠ和XbaⅠ酶切步驟（1）①得到的帶有相應酶切位點的胚乳特異性表達啟動子，然后與同樣經SacⅠ和XbaⅠ酶切的骨架載體pUC19連接，得到含有胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的重組載體pUC19-p22/6；

（2）構建插入正向目的片段22-KD-P和胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的重組載體pUC19-p22/6-22KD1

①22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的獲得

以玉米籽粒總RNA為模板，以SEQ?ID?NO:4和SEQ?ID?NO:5所示序列的R22-6引物對，進行RT-PCR擴增，然后以此RT-PCR產物為模板，以SEQ?ID?NO:6和SEQ?ID?NO:7所示序列的R22-7引物對，再進行RT-PCR，得到如SEQ?ID?NO:8所示的22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P；

②構建插入正向目的片段22-KD-P和胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的重組載體pUC19-p22/6-22KD1

用SmaⅠ和XbaⅠ雙酶切步驟（2）①得到的帶有相應酶切位點的目的片段22-KD-P，然后與同樣經SmaⅠ和XbaⅠ雙酶切的步驟（1）②構建的重組載體pUC19-p22/6連接，得到插入了正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的重組載體pUC19-p22/6-22KD1；

（3）構建插入反向目的片段22-KD-P的重組載體pUC19-22KD2

用HindⅢ和XbaⅠ酶切步驟（2）①得到的帶有相應酶切位點的目的片段22-KD-P，然后與同樣經HindⅢ和XbaⅠ酶切的pUC19載體連接，得到插入反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的重組載體pUC19-22KD2；

（4）構建含有終止子poly(A)的重組載體pUC19-22KD2-poly(A)

以表達載體p3301?DNA為模板，用SEQ?ID?NO:9和SEQ?ID?NO:10所示序列的終止子poly(A)的上下游引物進行PCR擴增，得到如SEQ?ID?NO:11所示序列的終止子poly(A)；進一步用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切帶有相應酶切位點的終止子poly(A)，然后與同樣經XhoⅠ和HindⅢ雙酶切的步驟（3）得到的重組載體pUC19-22KD2連接，得到含有終止子poly(A)的重組載體pUC19-22KD2-poly(A)；?

（5）構建含有胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6，正、反向目的片段22-KD-P和終止子poly(A)的重組載體pUC19-p22/6-22KD1-22KD2-poly(A)

將步驟（2）構建的重組載體pUC19-p22/6-22KD1和步驟（4）構建的重組載體pUC19-22KD2-poly(A)分別用XbaⅠ和HindⅢ雙酶切，然后將含有反向目的片段22-KD-P和終止子poly(A)的酶切產物22KD2-poly(A)連接到步驟（2）構建的重組載體pUC19-p22/6-22KD1上，得到含有胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6，正、反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和終止子poly(A)的重組載體pUC19-p22/6-22KD1-22KD2-poly(A)；?

（6）GUS基因內含子的連接和玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的構建

以質粒載體pGreen-0229?Backbone?DNA為模板，用SEQ?ID?NO:12和SEQ?ID?NO:13所示序列的GUS基因內含子的上下游引物進行PCR擴增，得到如SEQ?ID?NO:14所示的GUS基因內含子；進一步用XbaⅠ單酶切帶有相應酶切位點的GUS基因內含子，然后與同樣經XbaⅠ單酶切后磷酸化處理的步驟（5）構建的重組載體pUC19-p22/6-22KD1-22KD2-poly(A)連接，得到所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD，玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:15所示。