[發明專利]一種表達定向進化L-乳酸脫氫酶的工程菌及應用

有效

• 申請號: 201210010514.6
• 申請日: 2012-01-13
• 公開（公告）號: CN102559570A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 許平;姜天翼;高超;馬翠卿
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P41/00;C12P7/42;C12P7/40;C12R1/19
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 王緒銀

1.一種表達定向進化L-乳酸脫氫酶的工程菌，其特征在于：所述工程菌是一種能夠外源表達定向進化的煙酰胺腺嘌呤雙核苷酸(NAD)非依賴型L-乳酸脫氫酶的工程大腸桿菌，由如下方法構建獲得：

(1)設計并合成PCR引物，自施氏假單胞菌(Pseudomonas?stutzeri?SDM)CCTCC?No.M206010菌株的基因組中擴增L-iLDH的基因lldD(Genbank序列號GU373722)；其中所述引物是：

上游引物lldU：AAGCTTATGATCATTTCCGCCTCTACC，

下游引物lldD：CTCGAGTCAGACGTCAGCAGACGTTG；

(2)選取L-iLDH基因lldD中的108位的纈氨酸作為目標位點，設計并合成含有突變位點的PCR引物，通過PCR反應，將lldD基因第323的胸腺嘧啶核苷酸(T)改變為胞嘧啶核苷酸(C)，即相應于將蛋白質序列108位的纈氨酸(Val)突變為丙氨酸(Ala)，得到突變L-iLDH基因mlldD；其中所述引物是：

上游引物lmU：TTCACCCTTTCCACCGCGTCGGTCT，

下游引物lmD：GGGAATCCCTTTCTTGTCTGCCGC；

(3)以含有T7啟動子和氨芐青霉素抗性的大腸桿菌宿主適用表達載體pETDuet-1出發，將突變L-iLDH基因mlldD序列通過T4DNA連接酶連接至表達載體，構建表達載體pETDuet-1-mlldD；

(4)使用化學轉化的方法將表達載體pETDuet-1-mlldD轉化至大腸桿菌C43(DE3)所制備的感受態細胞中，將轉化細胞涂布于含有氨芐青霉素抗性的固體LB培養基上，篩選得到含有連接突變L-iLDH基因表達載體的轉化子，即得到表達突變蛋白的煙酰胺腺嘌呤雙核苷酸(NAD)非依賴型L-乳酸脫氫酶的工程大腸桿菌。

2.權利要求1所述表達定向進化L-乳酸脫氫酶的工程菌在拆分外消旋扁桃酸中的應用。

3.如權利要求2所述的應用，其特征在于：所述表達定向進化L-乳酸脫氫酶的工程菌的全細胞作為催化劑進行外消旋扁桃酸的拆分，同時生產手性純R-扁桃酸以及苯乙酮酸。

4.如權利要求3所述的應用，其特征在于：所述工程菌的全細胞作為催化劑進行外消旋扁桃酸的拆分的方法是：

(1)制備表達定向進化L-乳酸脫氫酶工程菌的完整細胞催化劑：將工程菌種子以體積比1％的接種量接種至LB培養基中，37℃培養；OD₆₂₀nm達到0.5～0.7時，加入終濃度為0.8～1.2毫摩爾/升的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，開始誘導突變蛋白進行表達；繼續在30～37℃誘導蛋白表達6～10小時后，終止培養；分離并收集菌體，用pH?7.4磷酸鉀緩沖液洗滌菌體2次，菌體重懸于去離子水中，得到作為催化劑的表達定向進化L-乳酸脫氫酶工程菌的完整細胞懸液；

(2)將上述催化劑與外消旋扁桃酸鈉水溶液混合，加入20～25毫摩爾/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，使混合物中外消旋扁桃酸鈉的濃度為20～40克/升；催化劑完整細胞濃度?為80～120克濕細胞/升，在30～42℃，pH?6.5～7.5條件下，使底物外消旋扁桃酸鈉、催化劑與氧氣充分混合，并以120轉～180轉/分鐘振蕩培養36～48小時，得含R-扁桃酸鈉以及苯乙酮酸鈉的轉化液。

5.如權利要求4所述的應用，其特征在于：步驟(2)所述方法是將上述催化劑與外消旋扁桃酸鈉水溶液混合，加入25毫摩爾/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，使混合物中外消旋扁桃酸鈉的濃度為40克/升；催化劑完整細胞濃度為100克濕細胞/升，在37～42℃，pH?7.0條件下，使底物外消旋扁桃酸鈉、催化劑與氧氣充分混合，并以150轉/分鐘振蕩培養40～45小時，得含R-扁桃酸鈉以及苯乙酮酸鈉的轉化液。?