[發明專利]一種卵白蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法

有效

• 申請號: 201210010496.1
• 申請日: 2012-01-13
• 公開（公告）號: CN102539788A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 盧士英;李巖松;柳增善;任洪林;周玉;馮小麗;宋杰;張茂林;李兆輝
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 魏征驥

技術領域

本發明屬于生物檢驗檢疫領域，通過將卵清白蛋白免疫實驗動物獲得多克隆抗體，建立卵清白蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法。?

背景技術

食物過敏是對食物中蛋白質分子產生的一種不良免疫反應。流行病學調查顯示,?25%?以上的人群受到過敏疾病的困擾。世界衛生組織(WHO?)將牛奶、雞蛋、魚、甲殼類(蝦、蟹、龍蝦)、花生、大豆、核果類(杏、板栗、腰果等)及小麥這8類食物定為常見的過敏食物。?

雞蛋中的蛋白質屬于優質蛋白質，除了含有成年人所需要的八種必需氨基酸外，還含有嬰幼兒必須通過膳食補充的組氨酸，更是唯一一個蛋白質生物價達100的天然食物。然而正是這些對人體相當有益的蛋白質卻可能成為兒童患過敏性疾病的禍首。不僅是兒童，某些先天性遺傳缺陷的成年人同樣有著對雞蛋過敏的煩擾。據報道，雞蛋過敏的高危人群為嬰幼兒和兒童，是兒童繼發性營養不良的原因之一。?

迄今為止，雞蛋過敏尚無特效療法，嚴格避免食用帶雞蛋的食物是雞蛋過敏患者的最佳選擇。然而雞蛋營養豐富，若從雞蛋過敏患者的膳食中除去雞蛋，勢必造成其營養不均衡。而且，由于現在食物配料的多樣化，使食物的組成變得十分復雜，雞蛋過敏患者很難避免遭受危害，因此，雞蛋過敏已經嚴重影響了部分人群的生活質量，甚至危急生命，值得我們去關注和研究。?

雞蛋中的過敏原主要存在于蛋清中，目前公認蛋清中有4?種蛋白成分能與人類血清結合而引起過敏反應，為雞蛋的主要過敏原，它們分別是卵類黏蛋白、卵白蛋白OVA、卵轉鐵蛋白和溶菌酶。?

目前國內檢測卵白蛋白主要利用進口的酶聯免疫檢測試劑盒，靈敏度高，重復性好，但是價格昂貴，而國內尚沒有市售的OVA?ELISA?檢測試劑盒。一般企業為節約檢測成本，只使用其檢測疫苗原液及成品，無法廣泛用于工藝評價。?

發明內容

本發明提供一種卵白蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法，目的是建立快速、有效、低成本的卵白蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法。?

本發明采取的技術方案是：?

（一）抗卵白蛋白的單克隆抗體制備：

（a）采用免疫方案免疫健康BALB/C雌性小鼠足墊快速免疫方案：用1mg/mL的卵白蛋白100μL與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化器乳化40min；使用乙醚將3只BALB/C小鼠分別麻醉后，用酒精棉對小鼠的兩只后腳掌消毒，皮下注射，每只后腳掌注射免疫原30μL；首免后七天用1mg/mL的BALB/C?100μL與等量的弗氏不完全佐劑混合均勻后注射方法同上，首次免疫后14天斷尾采血檢測小鼠血清效價；

（b）細胞融合及陽性雜交瘤細胞株的篩選與克隆:

強免后3天的小鼠眼球采血，分離血清留作陽性對照，無菌取出小鼠脾臟，用注射器吸取1640培養基反復沖洗脾臟以制備脾細胞懸液，按1：5～10的比例與SP2/0細胞充分混合，在37℃水浴下與50%PEG1000進行細胞融合；將融合后的細胞懸液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培養液中，加入事先鋪好飼養細胞的96孔細胞培養板中，每孔100ul，放入37℃、5%CO₂培養箱中培養；并分別于第4天、7天和10天，根據細胞生長狀況補加或更換HAT培養基；待克隆細胞生長至孔底1/4面積以上時，用間接ELISA法檢測上清抗體效價，篩選陽性雜交瘤細胞，并選擇陽性高、細胞生長狀態好的孔，采用有限稀釋法進行克隆，然后擴大培養、凍存，直到所有的克隆細胞孔都為陽性為止；先后兩次細胞融合的融合率分別為20.3%和73.1%，陽性率分別為0和1.78%，經過三次克隆化篩選，最后獲得一株能穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株命名為4E9，2011年12月7日在地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號是CGMCC?No.5557，分類命名：產雞卵白蛋白單克隆抗體細胞株；親和力常數為4.8×10⁸M^-1；

（二）制備抗卵白蛋白的多克隆抗體：

（a）用卵白蛋白OVA免疫3只健康新西蘭大白兔，免疫劑量為1mg/1mL/只，第一次免疫用弗式完全佐劑與等體積的卵白蛋白OVA乳化完全后于頸部及背部皮下結合后腿根部肌肉多點注射，以后每隔2周加強免疫一次，加強免疫用弗氏不完全佐劑，免疫劑量及免疫方法同第一次免疫，第三次加強免疫后10天耳緣靜脈采血并分離血清，用雙向免疫瓊脂擴散方法測定血清效價，當血清效價達到2⁴及以上時，心臟采血并在37℃放置2h，4℃靜置過夜后3000rpm離心20min，收集血清，即獲得多克隆抗體；