[發(fā)明專利]一種卵白蛋白雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210010496.1
• 申請(qǐng)日: 2012-01-13
• 公開（公告）號(hào): CN102539788A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧士英;李巖松;柳增善;任洪林;周玉;馮小麗;宋杰;張茂林;李兆輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 魏征驥

1.一種卵白蛋白雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，其特征在于包括下列步驟：

（一）抗卵白蛋白的單克隆抗體制備：

（a）采用免疫方案免疫健康BALB/C雌性小鼠足墊快速免疫方案：用1mg/mL的卵白蛋白100μL與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化器乳化40min；使用乙醚將3只BALB/C小鼠分別麻醉后，用酒精棉對(duì)小鼠的兩只后腳掌消毒，皮下注射，每只后腳掌注射免疫原30μL；首免后七天用1mg/mL的BALB/C?100μL與等量的弗氏不完全佐劑混合均勻后注射方法同上，首次免疫后14天斷尾采血檢測(cè)小鼠血清效價(jià)；

（b）細(xì)胞融合及陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選與克隆:

強(qiáng)免后3天的小鼠眼球采血，分離血清留作陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌取出小鼠脾臟，用注射器吸取1640培養(yǎng)基反復(fù)沖洗脾臟以制備脾細(xì)胞懸液，按1：5～10的比例與SP2/0細(xì)胞充分混合，在37℃水浴下與50%PEG1000進(jìn)行細(xì)胞融合；將融合后的細(xì)胞懸液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培養(yǎng)液中，加入事先鋪好飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100ul，放入37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；并分別于第4天、7天和10天，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況補(bǔ)加或更換HAT培養(yǎng)基；待克隆細(xì)胞生長(zhǎng)至孔底1/4面積以上時(shí)，用間接ELISA法檢測(cè)上清抗體效價(jià)，篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，并選擇陽(yáng)性高、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好的孔，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，然后擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存，直到所有的克隆細(xì)胞孔都為陽(yáng)性為止；先后兩次細(xì)胞融合的融合率分別為20.3%和73.1%，陽(yáng)性率分別為0和1.78%，經(jīng)過(guò)三次克隆化篩選，最后獲得一株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株命名為4E9，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)是CGMCC?No.5557，分類命名：產(chǎn)雞卵白蛋白單克隆抗體細(xì)胞株；親和力常數(shù)為4.8×10⁸M^-1；

（二）制備抗卵白蛋白的多克隆抗體：

（a）用卵白蛋白OVA免疫3只健康新西蘭大白兔，免疫劑量為1mg/1mL/只，第一次免疫用弗式完全佐劑與等體積的卵白蛋白OVA乳化完全后于頸部及背部皮下結(jié)合后腿根部肌肉多點(diǎn)注射，以后每隔2周加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑，免疫劑量及免疫方法同第一次免疫，第三次加強(qiáng)免疫后10天耳緣靜脈采血并分離血清，用雙向免疫瓊脂擴(kuò)散方法測(cè)定血清效價(jià)，當(dāng)血清效價(jià)達(dá)到2⁴及以上時(shí)，心臟采血并在37℃放置2h，4℃靜置過(guò)夜后3000rpm離心20min，收集血清，即獲得多克隆抗體；

（b）多克隆抗體的純化

采用辛酸-硫酸銨法純化兔血清，具體操作如下：（1）1份血清加入3份醋酸鹽緩沖液（pH?4.5），混合均勻后于30min內(nèi)逐滴加入正辛酸，邊加邊攪拌，加入辛酸的量為75ul/mL兔血清，4℃靜置1h；（2）4℃以12000rpm離心30min，棄沉淀收集上清并準(zhǔn)確記錄體積，加入1/10倍體積的PBS（0.01M，pH7.0），調(diào)pH至7.2,然后逐滴加入飽和硫酸銨至50%飽和，邊加邊攪拌，4℃靜置2h；(3)?4℃,12000rpm離心15min,棄上清，沉淀用適當(dāng)體積的PBS（0.01M，pH7.0）溶起，逐滴加入飽和硫酸銨至33%飽和,4℃靜置2h；（4）重復(fù)第3步；5）4℃,12000rpm離心15min,棄上清，沉淀用適當(dāng)體積的PBS（0.01M，pH7.0）溶起，并于4℃條件下在PBS（0.01M，pH7.0）中透析直到?jīng)]有硫酸根離子為止；紫外分光光度計(jì)測(cè)定純化后的蛋白濃度，并分裝保存至-80℃?zhèn)溆茫?/p>

(c)辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記多克隆抗體

純化后的多克隆抗體用一種活化的辣根過(guò)氧化物酶試劑盒標(biāo)記，標(biāo)記方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，具體操作方法如下：（1）1mg?HRP用50μL去離子水完全溶解后，加入50μL純化后的多克隆抗體溶液，含有多克隆抗體100μg，混合均勻后加入10μL左右的啟動(dòng)劑，調(diào)pH至9.5；（2）4℃放置12h，加入少量的硼氫化鈉，再加入終止劑，約3倍體積啟動(dòng)劑的量，調(diào)節(jié)pH至7.0左右；（3）加甘油至50%，-20℃保存?zhèn)溆茫?!-- SIPO -->

(d)卵白蛋白雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法

（1）用純化后的單克隆抗體4E9（5μg/mL）包被ELISA板，100?μL/孔，4℃包被過(guò)夜；

（2）0.1%的PBST洗滌3次，5min/次，拍干；

（3）加入新鮮配制的1%脫脂奶粉，100?μL/孔，37℃包被1h；

（4）0.1%的PBST洗滌3次，5min/次，拍干；

（5）加入系列稀釋的OVA標(biāo)準(zhǔn)品溶液或者待檢樣品及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的多克隆抗體（1:2000?倍稀釋），各100μL/孔，37℃孵育1h；

（6）0.1%的PBST洗滌3次，5min/次，拍干；

（7）加入OPD底物溶液，100μL/孔，37℃避光反應(yīng)15min；

（8）加入2M硫酸終止反應(yīng)，50μL/孔；

（9）酶標(biāo)儀492nm處讀值，記錄OD值；

（10）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待檢樣品中OVA含量。