[發(fā)明專利]家用冬蟲夏草鑒定試劑盒及其使用方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210002363.X
• 申請(qǐng)日: 2012-01-05
• 公開（公告）號(hào): CN102424860A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李治國(guó);俞國(guó)華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 李治國(guó);俞國(guó)華
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

[技術(shù)領(lǐng)域]

本發(fā)明涉及生物鑒定試劑盒，更具體地，涉及一種家用冬蟲夏草鑒定試劑盒及其使用方法。

[背景技術(shù)]

冬蟲夏草是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，冬蟲夏草已經(jīng)被用來治療高血糖癥、呼吸系統(tǒng)疾病、肝病、腎衰竭，并作為抗癌藥物和抗氧化劑等。目前，與冬蟲夏草有關(guān)的無性型菌種報(bào)到已有22個(gè)學(xué)名，涉及13個(gè)屬。經(jīng)過多年?duì)幷摚?005年10月，中國(guó)菌物學(xué)會(huì)在北京召開了《冬蟲夏草及其無性型研討會(huì)》，確定中國(guó)被毛孢(Hirsutella?sinensis)為冬蟲夏草唯一無性型菌種。目前市場(chǎng)上偽品和混淆品眾多，不容易區(qū)分，為臨床和推廣帶來了很多困難。

冬蟲夏草的鑒定多為生藥學(xué)的鑒定，主要針對(duì)外觀、顏色、氣味、味道等，這些方法比較主觀，也需要一定的經(jīng)驗(yàn)，普通人很難在短期內(nèi)掌握。目前也有一些使用液相色譜對(duì)其中的一些成分進(jìn)行檢測(cè)，從而進(jìn)行鑒定的報(bào)到，但是需要昂貴的大型設(shè)備，很難普及和現(xiàn)場(chǎng)使用。隨著分子生物學(xué)的深入研究，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)也被應(yīng)用到了冬蟲夏草的鑒定，同樣的也需要PCR儀、電泳儀等設(shè)備，而且存在著操作過程繁瑣的缺點(diǎn)。所以及時(shí)運(yùn)用生物技術(shù)發(fā)展的最新成果來進(jìn)行冬蟲夏草的鑒定具有重要意義。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)只需要一個(gè)恒溫環(huán)境就能夠產(chǎn)生肉眼可見的顏色變化，具有很多優(yōu)越性。

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)需要樣品的DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，其樣品的制備過程仍然有些復(fù)雜繁瑣，無法滿足家庭和現(xiàn)場(chǎng)使用。

因此需要一種鑒定結(jié)果直觀、操作簡(jiǎn)單、特異性好、適合家用的冬蟲夏草鑒定試劑盒及其使用方法來解決以上問題。

[發(fā)明內(nèi)容]

本發(fā)明的目的是在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種提供一種鑒定結(jié)果直觀、操作簡(jiǎn)單、特異性好、適合家用的冬蟲夏草鑒定試劑盒。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)：家用冬蟲夏草鑒定試劑盒包括以冬蟲夏草真菌ITS基因?yàn)榘谢颉⒒诃h(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的三對(duì)引物：內(nèi)引物FIP/BIP、外引物F3/B3和環(huán)引物L(fēng)B/LP。

核糖體RNA(rRNA)位于18s-28s?rDNA之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS區(qū))，它包括進(jìn)化上高度保守的5.8s?rDNA和包含有rDNA前體加工信息的兩個(gè)間隔區(qū)ITS-1、ITS-2。在rDNA多基因家族成員中，ITS是多拷貝，以串聯(lián)重復(fù)方式出現(xiàn)在一個(gè)或多個(gè)染色體基因位點(diǎn)上，同時(shí)ITS區(qū)又有通過不等交換和基因轉(zhuǎn)變等方式經(jīng)歷快速一致進(jìn)化的的特性，使得重復(fù)單位在基因組內(nèi)保持了高度一致性；而且ITS區(qū)兩側(cè)有高度保守序列存在，通過設(shè)計(jì)在保守區(qū)域上的引物擴(kuò)增ITS區(qū)，可以有效地解決系統(tǒng)發(fā)育和生物鑒別問題。ITS序列是真菌菌種和分離物鑒定的可靠依據(jù)。本發(fā)明就是針對(duì)該區(qū)域進(jìn)行冬蟲夏草的鑒定。

根據(jù)Genebank上的冬蟲夏草基因設(shè)計(jì)引物如下：

FIP：GTCGCAGTGGCATCTCTCAGTC-ATGCCCGCCAGAGTGC

BIP：AGGAGGGTCTGGGGGTCCTC-CAGCAGTTGCCTCGGC

F3：GGTTGAGATGACGCTCGGA

B3：CCCCCTGCGAACACCA

FL：TACTGCGCAGGGGAGC

BL：CCTGCGAACACCACAGC

作為本發(fā)明家用冬蟲夏草鑒定試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的冬蟲夏草鑒定試劑盒還包括：稀釋液、一次性移液管、反應(yīng)管。

作為本發(fā)明家用冬蟲夏草鑒定試劑盒的更優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的反應(yīng)管含有冷凍干燥物質(zhì)，凍干物質(zhì)含有：Bst?DNA聚合酶1～10單位/管，1.6～2mmol/L?dNTP、20～50mmol/LTris-HCl、10～20mmol/L?KCl、10～50mmol/L?MgSO4、0.1～0.5體積％TritonX-100、0.8～2mmol/L甜菜堿、0.2～2mol/L?HNB，內(nèi)引物FIP/BIP?0.6～1.6ummol/L、外引物F3/B30.1～0.4ummol/L、環(huán)引物L(fēng)B/LP?0.2～0.8ummol/L以上物質(zhì)溶于10～100ul水中，然后冷凍干燥處理。

作為本發(fā)明家用冬蟲夏草鑒定試劑盒的更優(yōu)選的實(shí)施方式，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)將待檢測(cè)、陰性和陽(yáng)性樣品分別用剪刀剪成盡可能小的薄片2～8片。

(2)分別放入稀釋液中，做好標(biāo)記，蓋好管蓋，搖晃混勻，靜置。

(3)分別用一次性移液管吸取上清滴加到反應(yīng)管。