[發(fā)明專利]花瓣內(nèi)含有花翠素的百合的生產(chǎn)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201180044560.1
• 申請日: 2011-09-16
• 公開（公告）號: CN103249301A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 田中良和;中村典子;小林仁;奧原宏明;近藤正剛;小池洋介;星洋介;野水利和
• 申請（專利權(quán)）人: 三得利控股株式會社;新潟縣
• 主分類號: A01H1/00
• 分類號: A01H1/00;A01H5/00;C12N15/09
• 代理公司: 北京金信立方知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11225
• 代理人: 黃威;蘇萌萌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及通過將外源基因轉(zhuǎn)入百合而使花瓣內(nèi)含有藍(lán)色色素（花翠素）的百合的生產(chǎn)方法。更具體地說，本發(fā)明涉及如下生產(chǎn)在花瓣內(nèi)含有藍(lán)色色素的百合的方法及通過該方法生產(chǎn)的百合，其中，為了在將花翠素合成所必需的來自風(fēng)鈴草的類黃酮3’，5’-羥化酶（F3’5’H）基因轉(zhuǎn)入百合的同時用RNAi法抑制對紅色色素（花青素）合成發(fā)揮作用的內(nèi)源性類黃酮3’-羥化酶（F3’H）的表達(dá)，轉(zhuǎn)入百合的F3’H基因的片段，使花翠素在百合花瓣內(nèi)合成。

背景技術(shù)

至今為止，已報道了通過在康乃馨（參照專利文獻(xiàn)1）、菊花（參照專利文獻(xiàn)1）、月季（參照專利文獻(xiàn)1、專利文獻(xiàn)2）、蝴蝶蘭（參照專利文獻(xiàn)3）、惠蘭（參照專利文獻(xiàn)3）中轉(zhuǎn)入外源基因，而在植物細(xì)胞中制造花翠素的方法。

但是，至今還沒有通過所轉(zhuǎn)入的外源基因的作用而在百合花瓣內(nèi)合成花翠素，以培育出具有藍(lán)色花瓣的百合的成功案例的報道。

作為植物的品種改良，具有（1）使雄蕊和雌蕊交配雜交，（2）自然或人為產(chǎn)生的突變，（3）基因重組等的方法。其中，利用（3）基因重組的技術(shù)時，可不受對象種所具有的遺傳性制約的限制，使有用基因在該植物中表達(dá)，并由此可賦予該植物原本不具有的新的性狀。使用基因重組技術(shù)培育出的基因重組植物現(xiàn)在已在全世界廣泛栽培。

作為花色的顏色素成分，有花色苷、類胡蘿卜素、甜菜素等。

花色苷為統(tǒng)稱為類黃酮的次級代謝產(chǎn)物之一，如圖1所示，通過由苯丙氨酸經(jīng)過香豆酰-CoA并通過很多酶的作用合成。花色苷的顏色依賴于其結(jié)構(gòu)。即作為花色苷的發(fā)色團(tuán)的花色素B環(huán)的羥基數(shù)越增多，越會變得更藍(lán)，作為主要花色素的花翠素、花青素、花葵素按此順序羥基增多。

在很多藍(lán)色花中，積累了來自花翠素的花色苷。此外，已知修飾花色苷的芳香族酰基（香豆酰基、咖啡酰基等）的數(shù)量增多時，花色苷的顏色變得更藍(lán)（即最大吸收波長向長波方向移動），花色苷的穩(wěn)定性增加。特別是復(fù)數(shù)的芳香族酰基結(jié)合的花色苷被稱為聚酰化花色苷，在龍膽、蝶豆等的藍(lán)色花瓣內(nèi)含有（參照非專利文獻(xiàn)1）。

涉及花色苷的生物合成的酶、編碼這些酶的基因已從很多的植物中分離（參照非專利文獻(xiàn)1）。花色苷的顏色也依賴于其所定位的液泡的pH、其他類黃酮、金屬離子等。即花色苷在液泡的pH低時變紅，為中性時變藍(lán)。此外，黃酮、黃酮醇也被稱為助色素，與花色苷共存時，具有使花色苷看上去更藍(lán)的效果。而且，已知鐵、鋁離子通過在花色苷的B環(huán)羥基上配位，使花色苷變藍(lán)。

植物會盛開多種顏色的花，但可盛開所有顏色的花的種很少。這是由于種的原因，可合成的色素由遺傳性決定。例如，月季、康乃馨、菊花、百合、非洲菊等中沒有藍(lán)色、紫色的品種。其主要理由是這些植物中不具有用于合成花翠素的必需的類黃酮3’，5’-羥化酶（以下也稱為“F3’5’H”。）基因。因此，已報道了一些通過使F3’5’H基因表達(dá)而生產(chǎn)花翠素，以使花色變藍(lán)的嘗試。

在F3’5’H缺陷的矮牽牛中使F3’5’H基因表達(dá)時，來自花翠素的花色苷量增加（參照非專利文獻(xiàn)2、非專利文獻(xiàn)3）。此外，在積累了花青素的煙草（Nicotiana?tabacum）中使F3’5’H基因表達(dá)時，可合成花翠素，花色稍帶有藍(lán)色（參照非專利文獻(xiàn)3）。使來自風(fēng)鈴草、洋桔梗、矮牽牛的F3’5’H基因在煙草中表達(dá)時，來自風(fēng)鈴草的F3’5’H基因最高效地生產(chǎn)花翠素（參照非專利文獻(xiàn)4）。此外，使蝶豆和馬鞭草的F3’5’H基因在馬鞭草中表達(dá)時，來自蝶豆的基因表達(dá)時花翠素生產(chǎn)量多，花色也明顯發(fā)生了變化（參照非專利文獻(xiàn)5）。使來自矮牽牛、龍膽、蝶豆、瓜葉菊、洋桔梗、三色堇、薰衣草等的F3’5’H基因在月季中表達(dá)時，結(jié)果僅有使來自三色堇的F3’5’H基因表達(dá)時生成了總花色素的10%數(shù)量的花翠素，表明在月季中，來自三色堇的F3’5’H基因良好地發(fā)揮了功能（參照專利文獻(xiàn)4）。