[發(fā)明專利]一種快速檢測微生物的磁性熒光試劑盒及其制備方法和使用方法

無效

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• 申請日: 2010-05-20
• 公開（公告）號: CN102253193A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發(fā)明（設計）人: 李莉;楊武利;府壽寬;府宇雷
• 申請（專利權）人: 上海醫(yī)脈賽科技有限公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/533;G01N33/531;G01N21/64
• 代理公司: 上海天翔知識產權代理有限公司 31224
• 代理人: 陳學雯

技術領域

本發(fā)明涉及一種快速檢測微生物的磁性熒光試劑盒及其制備方法和使用方法，具體涉及一種具有富集作用、可特異性、快速定量檢測導致感染性疾病的微生物的磁性熒光試劑盒組成、制備及使用方法。

背景技術

微生物的快速檢測方法是應用微生物學中一個迅速發(fā)展的領域，無論是對感染性疾病的控制和治療，還是食品安全的監(jiān)測和管理，都迫切需要快速的致病菌檢測方法。

目前對致病菌決速檢測主要采用微生物學、化學、生物化學、分子生物學、免疫學的方法對致病菌進行分離、檢測、鑒定和計數(shù)。目前這些致病菌檢測方法仍存在局限性，到目前為止，還沒有一種方法能簡便地從多種生物樣本中分離富集致病菌；進而，適時的回答出以下兩個問題：1、有沒有特定的致病菌，如威脅食品安全的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等，及嚴重威脅人類生命質量的結核分枝桿菌、肺炎鏈球菌(定性的檢查)；2、如果有，有多少？(定量的檢測)這對于確定致病菌及采用相應治療方法至關重要。

免疫磁性分離方法，是將特異性抗體偶聯(lián)在磁性顆粒表面，與樣品中被檢致病微生物發(fā)生特異性結合，載有致病微生物的磁性顆粒在外加磁場的作用下，向磁極方向聚集，并聚集在容器的內壁，稍后將標本液體移出，撒去磁場，收集磁性微球，可以將微生物從磁性微球上解離下來，這種方法可使致病微生物不但得以從多種樣品，如土壤樣品、食物樣品、臨床樣本中得到分離，而且也得到濃縮富集。

免疫磁性分離技術從乳及乳制品、肉類和蔬菜中分離出沙門氏菌，其檢測限為每克1×10²個細菌。Seo等將熒光免疫分析(FIA)與免疫磁性分離結合，測定接種于牛肉、蘋果汁和生牛奶中的低濃度大腸桿菌，每克牛肉中僅有4個大腸桿菌即可被檢出?？梢妼⒚庖叽判苑蛛x技術和其它檢驗方法，如酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，多聚酶鏈式反應(PCR)，熒光免疫分析(FIA)，電子化學發(fā)光(ECL)相結合，可以數(shù)倍地提高分離效率和檢測極限。而目前在微生物檢測中，所有與免疫磁性分離相結合的鑒定和檢測方法均包括后續(xù)生物化學、分子生物學、免疫學的檢查方法，操作繁瑣，設備條件要求高，應用前景不容樂觀。

熒光微球是一種載有熒光分子的功能性微球，由于其在單個微球中富集了能夠發(fā)射熒光的分子，在許多領域具有廣泛的應用前景。目前結合特異性抗體的熒光微球已用于標記和識別各種抗原，包括多糖、蛋白質、細胞等。所檢測的熒光強度則與待測物濃度線性相關，從而實現(xiàn)待測抗原的定性及定量檢測。該方法最突出的優(yōu)點是可以在同一體系中同時進行多標靶分析，特異性強，可實現(xiàn)快速診斷。

因此利用磁性納米微球的富集作用和熒光微球的定性定量等現(xiàn)代納米技術，結合現(xiàn)代生物檢測方法尋找一種簡單有效的方法快速富集各種微生物，并特異性、快速定性、定量檢測微生物是本發(fā)明需要解決的主要內容。

發(fā)明內容

本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種快速檢測微生物的磁性熒光試劑盒，以解決現(xiàn)有微生物檢測試劑盒所存在的諸多不足之處。該發(fā)明適用于醫(yī)院診斷，食品衛(wèi)生部門檢驗，或者科研機構研究使用。

本發(fā)明需要解決的技術問題之一是公開一種快速檢測微生物的磁性熒光試劑盒。

本發(fā)明需要解決的技術問題之二是提供該磁性熒光試劑盒的制備方法。

本發(fā)明需要解決的技術問題之三是提供該磁性熒光試劑盒的使用方法。

本發(fā)明的原理，參見圖1：

熒光微球由于微球的表面標有熒光物質或微球體內結構含有熒光物質的微球，受到外界能量刺激能激發(fā)出熒光。近年來，人們已經能夠制備各種各樣的粒徑從納米級到亞微米級的熒光微球。免疫熒光微球有比較穩(wěn)定的形態(tài)結構及發(fā)光行為，受溶劑、熱、電、磁等外界條件的影響比純熒光化合物小很多。將熒光分子或發(fā)光材料通過高分子層或二氧化硅殼材料包裹或連接，表面再偶聯(lián)靶向生物分子，則可形成具有靶向性的熒光納米粒子；制備了熒光染料染色的納米微球，通過特定的化學修飾，形成免疫磁性微球，可以使數(shù)千個熒光納米粒子與一個微生物的表面抗原結合，這種放大效應的檢測可實現(xiàn)對微生物的超高靈敏檢測。