[發明專利]一種細胞分離介質及細胞分離方法

有效

• 申請號: 201110456878.2
• 申請日: 2011-12-30
• 公開（公告）號: CN102533650A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 趙侃;樊曉翔;高長青;丁銀巧;高錦
• 申請（專利權）人: 北京京蒙高科干細胞技術有限公司;北京市星奧同創科技有限責任公司
• 主分類號: C12N5/0786
• 分類號: C12N5/0786;C12N5/078
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊;李玉秋

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種復方細胞分離介質及細胞分離方法。

背景技術

細胞治療技術如免疫細胞治療、干細胞治療極大的推動了現代醫學技術的發展。在細胞治療過程中，目標細胞的采集與分離是的一個重要步驟。高純度目標細胞的獲取是得到優良質量的細胞終產品即效應細胞的前提。在細胞治療過程中，除了需要用到治療用的效應細胞外，還有一類為獲取效應細胞而用到的輔助產品即細胞治療輔料，用于效應細胞的分離、生長、存儲、運輸及輸注等諸多環節，由于不在細胞治療的終產品中出現，其重要性通常被忽略。

密度梯度離心法(Density?Gradient?Centrifugation)作為一種傳統的分離技術，用于細胞分離已經存在了半個世紀。基于密度梯度離心法的細胞分離介質產品即細胞治療輔料，例如GE公司的Ficoll-PaquePLUS，已成為利用密度梯度離心法進行細胞分離的常規介質，特別是用于淋巴細胞的分離，其說明書推薦的相應操作步驟也已成為本領域技術人員公知的操作步驟。一般步驟包括：在離心管中加入一定體積的淋巴細胞分離介質，待分離的血液樣品平鋪于分離介質上，接著對其在恒定溫度下進行低速離心。樣品中各細胞群將由于密度差異分布在離心管的不同部位，例如，如果分離介質具有與目標細胞群相同的密度，目標細胞將富集在分離介質層與樣本層的交界面，用吸管將該層細胞吸出就達到了對目標細胞群的分離。由于Ficoll-Paque?PLUS本身并不在終產物中出現，其屬于一種典型的細胞治療輔料。

淋巴細胞作為一種效應細胞，廣泛存在于人外周血液、骨髓或人臍帶血中。高純度的淋巴細胞的獲取對于疾病的細胞學診斷、成分輸血、治療用細胞產品的制備等具有非常重要的意義。淋巴細胞分離介質是具有恒定密度、滲透壓及pH值的混合體系。國際上傳統的分離介質包括GE?Healthcare公司的產品Ficoll-Paque^TM?PLUS、Ficoll-Paque^TM?PREMIUM；Axis-Shield公司的產品Lymphoprep^TM；Sigma公司的產品Histopaque以及Mediatech公司的產品Lymphocyte?Separation?Medium(LSM)等。上述商品化的淋巴細胞分離介質以Ficoll?400(聚蔗糖400)和泛影酸鈉為主要成分，密度在1.073g/cm³和1.084g/cm³之間，滲透壓在280mOsmol/kg和310mOsmol/kg之間，pH在6和9之間。為了提高產品的技術標準以適應細胞治療特殊行業要求，GE?Healthcare公司在2005年推出的產品Ficoll-Paque^TMPREMIUM不僅依據ISO13485：2003將生產在受到嚴格控制的環境中進行，更是根據歐洲GMP附件1中“無菌醫藥產品的制造”和美國藥典USP<1043>關于細胞治療輔料的建議，將內毒素控制在了0.12EU/ml的范圍內，這個標準符合了靜脈注射用藥物對內毒素含量的要求。盡管如此，截至目前全球仍沒有一種分離介質宣稱可以用于臨床治療用途；上述產品的包裝說明書和使用指導中均明確指出該產品的適用范圍為研究而非體外診斷和治療用途。