[發(fā)明專利]與血清中刀豆素A特異結合的組織蛋白酶D酶原ConA-pCD及應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110454471.6
• 申請日: 2011-12-30
• 公開（公告）號: CN102492680A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發(fā)明（設計）人: 齊義軍;劉峰濤;楊永杰;劉瑞敏;林波;李濤;晁瑋霞;張軍;約翰遜·菲利普;馬遠方
• 申請（專利權）人: 河南大學
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;G01N33/574
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 時立新

1.一種與血清中刀豆素A特異結合的組織蛋白酶D酶原ConA-pCD，其特征在于，由下述方法制得：

①制備刀豆素A親和層析柱：在層析柱內加入100～1000?μl刀豆素A瓊脂糖凝膠，離心棄去流出液，然后加入1～5?ml含0.1%?Triton?X-100的糖蛋白結合緩沖液，旋轉搖床孵育5～15?min，離心棄去流出液，再加入1～5?ml糖蛋白結合緩沖液，旋轉搖床孵育5～15min，離心棄去流出液，備用；所述糖蛋白結合緩沖液組成為：30?mM?Bis-Tris,?150?mM?NaCl,?1～5?mM?CaCl₂,?1～5?mM?MnCl₂,?pH?6.0～7.2；

②取血清，離心后取20～100?μl上清并加入糖蛋白結合緩沖液至終體積為0.5～5?ml，然后轉入上述制備好的刀豆素A親和層析柱內，旋轉搖床于室溫孵育至少2?h或于4℃孵育10～12?h；然后離心棄去流出液，加入0.5～2?ml含200～400?mM甲基-α-D吡喃甘露糖苷的糖蛋白結合緩沖液，即刀豆素A結合糖蛋白的洗脫液；旋轉搖床孵育5～15?min,，離心并收集洗脫液，洗脫2～6次；

③在上述收集的洗脫液中加入-20℃的丙酮至丙酮體積終濃度為80%，-20℃放置10～12h，離心棄上清，室溫干燥后即得。

2.如權利要求1所述與血清中刀豆素A特異結合的組織蛋白酶D酶原ConA-pCD，其特征在于，所述步驟①為：在Poly-Prep層析柱內加入100?μl刀豆素A瓊脂糖凝膠，離心棄去流出液，然后加入2?ml含0.1%Triton?X-100的糖蛋白結合緩沖液，旋轉搖床孵育10min，離心棄去流出液，再加入2ml糖蛋白結合緩沖液，旋轉搖床孵育10min，離心棄去流出液，備用；所述糖蛋白結合緩沖液組成為：30?mM?Bis-Tris,?150?mM?NaCl,?1?mM?CaCl₂,?1?mM?MnCl₂,?pH?7.2。

3.如權利要求1所述與血清中刀豆素A特異結合的組織蛋白酶D酶原ConA-pCD，其特征在于，所述步驟②為：取血清，離心后取20?μl上清并加入糖蛋白結合緩沖液至終體積為1?ml，然后轉入上述制備好的刀豆素A親和層析柱內，旋轉搖床于室溫孵育2?h或于4℃孵育10～12?h；然后離心棄去流出液；加入1?ml含200?mM甲基-α-D吡喃甘露糖苷的糖蛋白結合緩沖液，即刀豆素A結合糖蛋白的洗脫液；旋轉搖床孵育10?min,，離心并收集洗脫液，洗脫4次。