[發(fā)明專利]一種選育甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110453812.8
• 申請(qǐng)日: 2011-12-29
• 公開（公告）號(hào): CN102550393A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王幼平;李愛民;蔣金金;王娟;張永泰;韋存虛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號(hào): A01H1/02
• 分類號(hào): A01H1/02
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

利用電融合方法實(shí)現(xiàn)雜交雙親細(xì)胞質(zhì)的重組，結(jié)合常規(guī)雜交獲得一種甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料，可用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和油菜育種領(lǐng)域。

背景技術(shù)

細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)是母性遺傳現(xiàn)象，是植物雜種優(yōu)勢(shì)利用的一個(gè)重要途徑，而雜種優(yōu)勢(shì)利用是提高油菜產(chǎn)量的重要手段。目前我國(guó)油菜生產(chǎn)中所使用的雜交種70%左右是以細(xì)胞質(zhì)雄性不育作為授粉控制系統(tǒng)配制而來(lái)。

我國(guó)目前油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系以Pol?CMS和Shan2A?CMS為主，在生產(chǎn)上主要存在以下主要問(wèn)題：①?PolCMS和Shan?2A?CMS?育性不穩(wěn)定，對(duì)低溫敏感，初花期如果遇低溫會(huì)產(chǎn)生微粉，微量花粉會(huì)引起自交結(jié)實(shí)，因此雜種純度難以保證，具有較大的生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。②?細(xì)胞質(zhì)類型較為單一，我國(guó)雜交油菜生產(chǎn)上主要使用PolCMS和Shan?2A?CMS不育系，這兩種不育系基本上屬同一類型，增加了由于單一細(xì)胞質(zhì)引起的生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。③?由于專利權(quán)的限制，一些國(guó)外優(yōu)秀不育系在國(guó)內(nèi)難以直接應(yīng)用。如Ogu?CMS?雖然育性穩(wěn)定，但已在法國(guó)申請(qǐng)專利。因此，進(jìn)一步創(chuàng)建油菜細(xì)胞質(zhì)不育類型，并應(yīng)用于油菜育種是非常重要的。

發(fā)明內(nèi)容

通過(guò)電融合的方法克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性，從白芥－甘藍(lán)型油菜體細(xì)胞雜種后代中獲得的細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料，具有雙親的線粒體基因組，不育性徹底、穩(wěn)定。經(jīng)遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，認(rèn)為是一種來(lái)源不同的新型細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料。

通過(guò)電融合的方法克服屬間雜交不親和性，獲得甘藍(lán)型油菜和白芥屬間雜種，由于是體細(xì)胞雜交，實(shí)現(xiàn)了二個(gè)親本（甘藍(lán)型油菜和白芥）細(xì)胞質(zhì)的融合，這是和常規(guī)有性雜交是不同的，研究表明細(xì)胞質(zhì)控制的不育基因是在線粒體中。

本發(fā)明所述選育甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料的方法，包括以下步驟：

（1）電融合制備白芥和甘藍(lán)型油菜體細(xì)胞雜種；

（2）將上述得到的白芥和甘藍(lán)型油菜體細(xì)胞雜種用甘藍(lán)型油菜進(jìn)行連續(xù)回交，從回交后代中篩選得到染色體數(shù)為38條的不育株；

（3）將不育株與甘藍(lán)型油菜品系進(jìn)行測(cè)交，篩選獲得保持系，利用該保持系連續(xù)回交，選育出甘藍(lán)型油菜不育系。

從白芥和甘藍(lán)型油菜體細(xì)胞雜種后代中篩選獲得甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料，該材料不育性穩(wěn)定、徹底。同時(shí)通過(guò)電融合方法獲得的材料，和常規(guī)有性雜交不同，并擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，可直接用于雜種油菜的生產(chǎn)，通過(guò)三系配套和雜交育種，為雜交油菜生產(chǎn)提供一種新的不育材料，具有非常大的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明育種流程示意圖。

圖2是新型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育材料花的形態(tài)?(A:保持系;?B-D:不育材料)。

圖3是不育系和可育株小孢子發(fā)育的比較，A-C，不育株，D-F，可育株。

圖4是雜交親本和現(xiàn)有的PolCMS不育材料線粒體DNA的擴(kuò)增結(jié)果，其中：1-白芥，2-甘藍(lán)型油菜可育株，3-PolCMS不育材料，4-本發(fā)明不育材料。

圖5.?不育株染色體數(shù)（2n=38）,用白芥基因組作探針。

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。

下面結(jié)合具體的數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

通過(guò)電融合方法實(shí)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜與白芥的體細(xì)胞雜交和父母雙親細(xì)胞質(zhì)的重組

分別取甘藍(lán)型油菜（‘揚(yáng)油6號(hào)’）和白芥組培苗的幼葉（4-5周），用常規(guī)方法分離原生質(zhì)體，甘藍(lán)型油菜和白芥原生質(zhì)體按1：1.2的比例混合，用0.4mol/L甘露醇（mannitol）將原生質(zhì)體的密度調(diào)至5′10⁵/mL。用電融合儀（CFA500,?Muenster,?Germany)在下列參數(shù)下進(jìn)行融合：

得到將白芥和甘藍(lán)型油菜屬間雜種（體細(xì)胞雜種）。

體細(xì)胞雜種和回交后代的染色體數(shù)目的鑒定