[發明專利]一種高靈敏量子點免疫滲濾熒光定量檢測方法

有效

• 申請號: 201110452812.6
• 申請日: 2011-12-29
• 公開（公告）號: CN102539771A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 王東
• 申請（專利權）人: 北京康美天鴻生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/558;G01N21/64
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊;李玉秋

技術領域

本發明公開了一種基于量子點的免疫滲濾熒光定量檢測方法，可實現病原體、重大疾病(如腫瘤、心血管疾病等)、毒品檢測、藥品和食品安全等目標被測物的定量檢測，屬于熒光檢測技術領域。

背景技術

免疫滲濾(IFA)是一種在臨床檢驗中常見的方法，其基本原理是：以一硝酸纖維素(NC)膜為載體，利用微孔濾膜的可濾過性，使抗原抗體反應和洗滌在一特殊的滲濾裝置上以液體滲濾過膜的方式迅速完成。免疫滲濾實驗最初是從斑點ELISA基礎上發展建立起來的，應用的結合物是酶標記的。滲濾裝置是IFA中的主要試劑成分之一，由塑料小盒、吸水塑料和點加了抗原或抗體的硝酸纖維素膜片三部分組成。塑料小盒可以是多種形狀的，盒蓋的中央有一直徑約為0.4～0.8cm的小圓吸孔，盒內墊放吸水塑料，NC膜片安放在正對盒蓋的圓孔下，緊密關閉盒蓋，是NC膜片貼緊水塑料。如此即制備成一滲濾裝置。20世紀90年代初發展了以膠體金為標記物的金免疫滲濾實驗(GIFA)，省卻了酶對底物的反應，更加簡單、快速。

免疫金標記技術利用膠體金大量聚集而顯色，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這種方法具有快速、簡便、準確等優點，在檢測抗原、抗體中得到了廣泛使用。免疫膠體金在醫學檢驗中最常用的有免疫膠體金斑點滲濾試驗和免疫膠體金層析試驗兩種方法。相比較而言，由于免疫膠體金與樣本中被測物之間的呈色標記反應在均相介質中進行，使反應充分，故免疫膠體金斑點滲濾技術具有非常敏感、非?？芍貜停焖儆趾啽愕忍攸c，是發展敏感度和準確性更好的金標法快速斑點滲濾定量檢測診斷試劑盒的前提。

中國專利200710044730.1提供了一種快速、簡便、準確的快速定量檢測C-反應蛋白的膠體金法。反應原理為固相雙抗體夾心法的金標免疫斑點滲濾試驗，樣本經40～480倍稀釋后與免疫膠體金在液相均質介質中混和均勻，再轉加到反應板上，其中所含的、已與免疫膠體金在一起的被測物能為膜上固定的抗被測物另一決定簇的單抗或多抗特異性地捕獲，呈紅色斑點，斑點色澤與樣本中CRP濃度旱正比。

量子點(Quantum?dots，QDs)又叫半導體納米晶，通常是由II～VI族或III～V族元素組成的穩定的、尺寸介于1～20nm之間的納米微晶體，是20世紀90年代發展的一種具有優良光譜特性和光化學穩定性的生物熒光標記物。其具有許多優良的光學特性：(1)量子點的熒光發射光譜窄而對稱，熒光發射波長可調，且覆蓋范圍可從紫外到近紅外區。(2)量子點的吸收光譜寬且連續，可實現一元激發，多元發射，適合于多色標記。(3)量子點具有較強的光學穩定性。CdSe/ZnS量子點的光穩定性是羅丹明6G的100倍以上。(4)量子點摩爾吸光系數可以高達10⁶L/(mol·cm)，且熒光量子產率高(50～80％)，因而可產生較強熒光信號。(5)量子點斯托克斯位移較大，熒光壽命長(20～50ns)，使得信號可以顯著區分于背景和其它熒光基團。量子點是一種理想的應用于超靈敏和多組分生物化學分析的熒光探針，在熒光免疫分析和多組分檢測、免疫示蹤分子定位、納米生物傳感器、實時檢測、細胞成像、體內成像、疾病診斷等方面具有獨特的作用和廣泛應用前景。根據文獻報道，量子點作為新一代生物熒光標記物，具有取代傳統有機染料的潛力。

相比于熒光檢測，膠體金定量在靈敏度和線性范圍上均有不足。而量子點熒光定量檢測方法利用量子點多波長激發、高強度熒光強度、發射峰窄、峰形對稱、發光穩定性好的熒光特性，可提供一種量子點標記快速免疫滲濾檢測方法，對被測物進行高靈敏定量檢測。本方法只需改變量子點的粒徑或種類，就可得到不同波長的熒光，用不同類型的量子點標記不同的抗體，可產生多色熒光，實現多組分的檢測，方法簡單快速，靈敏度高。因此，需要一種方法使量子點應用于免疫滲濾檢測，以克服膠體金定量在靈敏度和線性范圍上的不足。

發明內容

本發明針對膠體金免疫滲濾定量技術的不足和缺陷，利用弱熒光層析膜、極弱熒光吸水墊、極弱熒光扣卡等降低熒光背景，利用量子點多波長激發、高強度熒光發射、發射峰窄、峰形對稱、發光穩定性好、熒光發射波長可調等特性提高熒光信號，提供一種基于量子點的快速免疫滲濾法檢測的試劑盒，對被測物進行半定量或定量檢測。本發明方法簡單、準確、快速、特異、靈敏，成本低，適用于血樣、尿樣、唾液、糞便等樣本，應用于重大疾病(如腫瘤、心血管疾病等)、毒品檢測、食品安全等檢測，可在醫院、海關、機場、家庭等場所使用。

為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案為：