[發(fā)明專(zhuān)利]一種高通量、非破壞性種子組織的取樣方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110451381.1
• 申請(qǐng)日: 2011-12-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102533935A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏正俊;吳士浩;吳紅艷
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/24
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/24;C12Q1/68
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 韓末洙

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及種子組織的取樣方法。

背景技術(shù)

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)及分子標(biāo)記得以迅速應(yīng)用，但目前還沒(méi)有與之相配套的簡(jiǎn)易高通量取樣技術(shù)，限制了該技術(shù)的發(fā)展。許多研究如數(shù)量遺傳性狀定位、植物數(shù)量性狀基因克隆以及分子育種，均需要從種子大量提取DNA，進(jìn)行基因型鑒定，從而選擇出有用的基因型個(gè)體，淘汰不需要用的基因型個(gè)體。傳統(tǒng)的從種子中來(lái)提取DNA的方法如“半粒種子法”，是一個(gè)非常復(fù)雜與繁瑣的過(guò)程，不能滿足現(xiàn)化高通量提取DNA的要求。另一方面，雖然美國(guó)孟山都公司的專(zhuān)利產(chǎn)品自動(dòng)無(wú)污染種子取樣器(中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)CN101437391)，可以用于種子取樣技術(shù)，但是由于該機(jī)器的價(jià)格十分昂貴，不利于推廣使用。最接近的方法為“鉆孔法”(Kamiya?and?Kiguchi?2003，Rapid?DNA?Extraction?Method?from?Soybean?Seeds，Breeding?Science?53(3)：277-279)，但是其操作程序復(fù)雜，鉆取單個(gè)種子費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，鉆取的植物組織采用玻璃紙、1.5毫升離心管或2.0毫升離心管收集，不適于高通量樣品的連續(xù)采集。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是要解決現(xiàn)有的種子取樣器價(jià)格昂貴，不利于推廣使用，以及現(xiàn)有的“鉆孔法”操作復(fù)雜，不適于高通量樣品連續(xù)采集的問(wèn)題，而提供一種高通量、非破壞性種子組織的取樣方法。

本發(fā)明一種高通量、非破壞性種子組織的取樣方法按照以下步驟完成：

一、準(zhǔn)備材料：植物種子、鉆頭、可調(diào)速臺(tái)鉆、孔板、移液管槍頭、空氣壓縮機(jī)、鋁箔紙；用雙層鋁箔紙將孔板上口處包裹嚴(yán)密，用膠帶將鋁箔紙邊緣固定在樣品板上，輕壓鋁箔紙，使孔板的樣品孔輪廓凸現(xiàn)；

二、鉆孔、收集胚乳組織：將可調(diào)速臺(tái)鉆放置于操作臺(tái)上，安裝上鉆頭，鉆孔的位置選取植物種子上遠(yuǎn)離胚胎的一側(cè)，使鉆頭不破壞種子胚胎，鉆頭轉(zhuǎn)速為200～400r/min，最初鉆取的表皮部分棄去，鉆至胚乳組織時(shí)，使用移液管槍頭收集，移液管槍頭小頭的一端用帶有乳膠手套的手指按住，將鉆取的胚乳組織從移液管槍頭大頭一端倒入移液管槍頭中，鉆孔后的種子編號(hào)存放；

三、轉(zhuǎn)移胚乳組織，將步驟二中盛有胚乳組織的移液管槍頭傾斜，使移液管槍頭與水平面呈10～30度角，移液管槍頭小頭一側(cè)位于低處，移開(kāi)按住移液管槍頭小頭的手指，用移液管槍頭的小頭將鋁箔紙刺破，將移液管槍頭插入孔板的樣品孔中，然后直立移液管槍頭，使胚乳組織流入到孔板的樣品孔中；

四、清洗，用空氣壓縮機(jī)吹出的高壓空氣將步驟二和三中使用的移液管槍頭、鉆頭和乳膠手套上沾有的胚乳組織吹走；

五、重復(fù)步驟二至四，直至完成所有種子的取樣。

本發(fā)明方法使用移液管槍頭收集鉆取的種子組織材料，并轉(zhuǎn)移至孔板中，轉(zhuǎn)移后利用高壓氣流清除所用共具上的殘余樣品后，進(jìn)行下一個(gè)種子的取樣。整個(gè)過(guò)程簡(jiǎn)單、高速。收集的種子組織材料用于進(jìn)行基因型鑒定及其它下游分析。鉆取后的種子編號(hào)存放，可用于科研與育種中。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明一種高通量、非破壞性種子組織的取樣方法，只需利用簡(jiǎn)單的設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)連續(xù)鉆取、收集種子組織樣品，同時(shí)保持種子的發(fā)芽勢(shì)，鉆取的種子組織并不需要粉碎，可以直接用于高通量的DNA基因型鑒定。本發(fā)明方法效率高，每人每日鉆取的植物種子組織樣品為4～6塊384樣品板，相當(dāng)于大豆種子1500～2300粒，與現(xiàn)有的鉆孔法相比，效率提高了7.5～11.5倍。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉的具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式之間的任意組合。

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式一種高通量、非破壞性種子組織的取樣方法按照以下步驟完成：

一、準(zhǔn)備材料：植物種子、鉆頭、可調(diào)速臺(tái)鉆、孔板、移液管槍頭、空氣壓縮機(jī)、鋁箔紙；用雙層鋁箔紙將孔板上口處包裹嚴(yán)密，用膠帶將鋁箔紙邊緣固定在樣品板上，輕壓鋁箔紙，使孔板的樣品孔輪廓凸現(xiàn)；

二、鉆孔、收集胚乳組織：將可調(diào)速臺(tái)鉆放置于操作臺(tái)上，安裝上鉆頭，鉆孔的位置選取植物種子上遠(yuǎn)離胚胎的一側(cè)，使鉆頭不破壞種子胚胎，鉆頭轉(zhuǎn)速為200～400r/min，最初鉆取的表皮部分棄去，鉆至胚乳組織時(shí)，使用移液管槍頭收集，移液管槍頭小頭的一端用帶有乳膠手套的手指按住，將鉆取的胚乳組織從移液管槍頭大頭一端倒入移液管槍頭中，鉆孔后的種子編號(hào)存放；