[發(fā)明專利]用于T淋巴細胞的體外培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110449100.9
• 申請日: 2011-12-29
• 公開（公告）號: CN102433303A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設計）人: 李文欣
• 申請（專利權）人: 遼寧邁迪生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司 21101
• 代理人: 刁佩德

技術領域

本發(fā)明涉及一種用于處理人外周血、臍帶血、胸水、腹水等樣品中的單個核細胞成為細胞因子誘導的殺傷細胞（Cytokine-Induced?Killer，簡稱CIK）的方法，特別是一種用于T淋巴細胞的體外培養(yǎng)方法，該方法可以應用于臨床細胞生物治療，也可以應用于基礎醫(yī)學研究、臨床應用研究及生物技術研究，尤其可以應用于免疫系統(tǒng)研究和腫瘤殺傷作用的研究。

背景技術

隨著腫瘤對人類生存健康的威脅日益嚴重，應對腫瘤的治療模式也發(fā)生著日新月異的變化，各種新藥物、新技術、新方法層出不窮，其中細胞生物治療是繼手術、放療和化療后發(fā)展的第四類腫瘤治療方法，成為腫瘤生物治療中重要的發(fā)展方向。癌癥是腫瘤細胞逃脫免疫監(jiān)視系統(tǒng)的細胞疾病，機體免疫功能的缺陷是癌癥發(fā)生和發(fā)展的關鍵。機體的抗腫瘤免疫主要為T淋巴細胞所介導。細胞生物治療技術將自體免疫細胞經(jīng)體外誘導、分化、擴增再回輸至體內(nèi)，繞過體內(nèi)腫瘤免疫障礙機制，通過激發(fā)機體的免疫反應來對抗、抑制和殺滅癌細胞。繼淋巴因子激活殺傷細胞、浸潤腫瘤淋巴細胞及分化抗原（Cluster?of?Differentiation,?簡稱CD）3單抗激活的殺傷細胞后，CIK的殺瘤作用日益受到重視。

CIK細胞是1991年由美國斯坦福大學施密特等首次報道。他們發(fā)現(xiàn)在體外模擬人體內(nèi)環(huán)境的條件下，外周血淋巴細胞可以被多種細胞因子定向誘導并增殖為一群具有高效細胞毒活性的異質(zhì)效應細胞。由于該細胞群同時表達CD3、CD8和CD56膜蛋白分子，故又稱為自然殺傷細胞樣T淋巴細胞，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和自然殺傷細胞的非主要組織相容性復合物限制性殺瘤的優(yōu)點，可特異性聚集于腫瘤局部發(fā)揮抗瘤殺瘤作用。CIK細胞在體內(nèi)歸巢于脾臟和淋巴結(jié)，在肝臟中分布最多，其次是外周血。其中CD3⁺、CD8⁺、CD56⁺是CIK細胞群中的主要效應細胞，在正常人外周血中僅占淋巴細胞的1-5%，而在體外經(jīng)多種因子刺激培養(yǎng)10-25天后，細胞數(shù)量較培養(yǎng)前可增加1000倍以上。

與其他過繼性免疫治療細胞相比，CIK細胞具有增殖快、殺瘤活性強、殺瘤譜廣、副作用小、對正常骨髓造血影響輕微等優(yōu)點。對化療耐藥的腫瘤細胞株有殺傷作用，而對正常造血集落細胞的生長沒有影響。通過取病人少量單個核細胞，在體外特定條件下制備出大量CIK細胞，回輸體內(nèi)后直接發(fā)揮有效清除腫瘤作用，尤其對手術后或放化療后患者效果顯著，能消除殘留微小的轉(zhuǎn)移病灶，防止癌細胞擴散和復發(fā)，提高機體免疫力，并實現(xiàn)了延長患者生存期，快速提高患者生活質(zhì)量等多重目標。因此，CIK被認為是新一代抗腫瘤過繼細胞免疫治療的優(yōu)選細胞。目前腫瘤生物治療中心應用樹突狀細胞（Dendritic?Cell，簡稱DC）和CIK細胞聯(lián)合回輸?shù)姆椒ǎ糜趷盒院谏亓觥⒛I癌、肺癌、肝癌、食道癌、胃癌、膀胱癌等疾病治療。但目前各個實驗室培養(yǎng)CIK的方法，使用材料，培養(yǎng)時間均不一致，導致有效細胞的培養(yǎng)周期、質(zhì)量和數(shù)量參差不齊，給臨床應用帶來了效果不穩(wěn)定的風險因素。

另外，在中國專利申請?zhí)枮?00910045790.4的“一種CIK細胞及其制備方法和細胞制劑”中，公開了一種CIK細胞及其制備方法和細胞制劑。其記載的CIK細胞的誘導因子組合為植物血凝素、抗CD3單抗和抗CD28單抗。該方案中所使用的植物血凝素是一種有絲分裂原，能激活小淋巴細胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞，繼而分裂增殖，釋放淋巴因子，提高巨噬細胞的吞噬功能，但由于其較難提純，且成本極高，所以一直以來僅在實驗室中作為刺激淋巴細胞增殖的試劑，很難應用于臨床的大規(guī)模使用。在中國專利申請?zhí)枮?00310109565.5的“一種CIK細胞體外培養(yǎng)方法”中，公開了一種CIK細胞體外培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)方法同樣采用了植物血凝素和抗CD3單克隆抗體兩種有絲分裂原聯(lián)合激活細胞，雖然能夠增強細胞的刺激強度，但該方法需要借助生物反應器完成，不僅成本高，使用不方便，且不利于醫(yī)學研究和臨床應用。

綜上，現(xiàn)有CIK細胞（T淋巴細胞）體外培養(yǎng)方法急需改進。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于T淋巴細胞的體外培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法可以用于T淋巴細胞體外定向分選、誘導、分化、培養(yǎng)、擴增。

本發(fā)明所采用的技術方案是：該用于T淋巴細胞的體外培養(yǎng)方法，包括對T淋巴細胞進行定向分選、誘導、分化、培養(yǎng)、擴增，其技術要點是：具體操作步驟如下：

第一步、對T淋巴細胞進行定向分選：