[發(fā)明專利]用于T淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110449100.9
• 申請日: 2011-12-29
• 公開（公告）號: CN102433303A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李文欣
• 申請（專利權(quán)）人: 遼寧邁迪生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責(zé)任公司 21101
• 代理人: 刁佩德

1.一種用于T淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，包括對T淋巴細(xì)胞進(jìn)行定向分選、誘導(dǎo)、分化、培養(yǎng)、擴(kuò)增，其特征在于：具體操作步驟如下：

第一步、對T淋巴細(xì)胞進(jìn)行定向分選：

將稀釋好的血細(xì)胞以1：1的比例緩慢注入細(xì)胞分選液上，并離心處理；用移液管吸出分選后的第一層液體即血漿或細(xì)胞組織均漿液層，棄去，吸取第二層細(xì)胞即環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞于新的離心管中；向新收集的細(xì)胞中補(bǔ)加生理鹽水，離心處理后棄上清；重復(fù)洗兩次；其中細(xì)胞分選液的配制方法為：取9%?Ficoll溶液720ml與33.4%泛影葡胺30ml充分混合，再向該混合液中加入7.5g的明膠，充分混勻；用高濃度的泛影葡胺或稀釋的Ficoll來調(diào)整溶液的相對密度至1.077g/ml；最后放入溫度為121℃的高壓蒸汽滅菌中30min，室溫保存?zhèn)溆茫?/p>

第二步、對T淋巴細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)、分化、培養(yǎng)：

取包被瓶一個，所述包被瓶是預(yù)先包被了CD3單克隆抗體、γ-干擾素、白細(xì)胞介素-1α三種因子的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用生理鹽水或培養(yǎng)基潤洗一次并棄去，加入患者自體血漿2~5ml；取培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，混勻后將其移入包被瓶中；而后用培養(yǎng)基潤洗離心管，將潤洗液再次移入包被瓶中；將包被瓶放入5%?CO₂、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；

包被瓶的制備：取CD3單克隆抗體、γ-干擾素、白細(xì)胞介素-1α加入到40ml磷酸鹽緩沖液中，CD3單克隆抗體、γ-干擾素、白細(xì)胞介素-1α三種因子的濃度比例為10:1:1，制成總濃度為1200ng/ml的混合溶液，充分混勻；將該混合溶液加入到600ml培養(yǎng)瓶中，4℃靜置至少24小時，制成初始包被瓶；將初始包被瓶在-40℃條件下冷凍24小時；啟動冷凍干燥機(jī)的壓縮機(jī)，使機(jī)器腔室內(nèi)的溫度降至-40℃，將包被瓶瓶口擰松，放入干燥室；開啟真空泵，使壓力達(dá)到<15Pa，真空凍干20小時；打開CO₂進(jìn)氣閥，關(guān)閉真空泵；待壓力到110K后關(guān)閉CO₂進(jìn)氣閥，取出包被瓶，擰緊蓋子，封好口，4℃保存；在規(guī)定的保質(zhì)期內(nèi)使用；

第三步、對T淋巴細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增：

吸取新鮮培養(yǎng)基溶解細(xì)胞因子A，即20萬單位的白細(xì)胞介素-2，注入包被瓶中，此時細(xì)胞因子A在培養(yǎng)瓶中的濃度為0.4萬單位/ml；于5%CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3天后，向包被瓶中補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基100ml；再于5%?CO₂，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1~2天，當(dāng)細(xì)胞基本鋪滿包被瓶底時，進(jìn)行轉(zhuǎn)袋；

用移液管吹下包被瓶中的貼壁細(xì)胞，用注射器吸取新鮮培養(yǎng)基溶解細(xì)胞因子B，即200萬單位的白細(xì)胞介素-2，加入包被瓶中，同時加入患者自體血漿2~5ml，將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)袋中；用新鮮培養(yǎng)基潤洗包被瓶兩次，將潤洗液一并倒入培養(yǎng)袋中，補(bǔ)加培養(yǎng)基至1000ml，此時細(xì)胞因子B在培養(yǎng)瓶中的濃度為0.2萬單位/ml；將培養(yǎng)袋放入5%CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~4天后，補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基1000ml，繼續(xù)放入5%CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；補(bǔ)液后第二天，進(jìn)行檢菌，證明培養(yǎng)袋中的培養(yǎng)物是否可以用于回輸治療或醫(yī)學(xué)研究。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于T淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征在于：還包括檢菌、回輸步驟：

所述檢菌時，取出培養(yǎng)袋，用注射器由取樣口吸取培養(yǎng)物分別注入兩個雙相血培養(yǎng)瓶中，一瓶送與第三方進(jìn)行無菌檢測，一瓶用于自檢；將雙向血培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；雙相血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)3天后若無菌生長，證明培養(yǎng)袋中的培養(yǎng)物可以用于回輸治療或醫(yī)學(xué)研究；

回輸時，準(zhǔn)備離心管8個，將培養(yǎng)物倒入離心管中，剩余培養(yǎng)物放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；4℃條件下，離心處理?xiàng)壢ド锨澹蒙睇}水重懸細(xì)胞并集中到2個離心管中；4℃條件下，離心處理?xiàng)壢ド锨澹挥蒙睇}水重懸細(xì)胞并集中到1個離心管中；4℃條件下，離心處理?xiàng)壢ド锨澹蒙睇}水重懸細(xì)胞；4℃條件下，離心處理?xiàng)壢ド锨澹蒙睇}水重懸細(xì)胞；用注射器吸取一只細(xì)胞分散劑注入新的離心管中，該細(xì)胞分散劑為10%人血清白蛋白，而后將無菌篩網(wǎng)放到該離心管上；吸取細(xì)胞懸液，注入裝有無菌濾器的離心管中；通過濾網(wǎng)濾去大的細(xì)胞團(tuán)；取回輸袋一個，倒入細(xì)胞并加生理鹽水備用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于T淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征在于：用于處理人外周血、臍帶血、胸水、腹水中的單個核細(xì)胞的體外定向分選、誘導(dǎo)、分化、培養(yǎng)、擴(kuò)增。