[發(fā)明專利]一種分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒及其使用方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110445821.2
• 申請日: 2011-12-28
• 公開（公告）號(hào): CN102492654A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葛龍海
• 申請（專利權(quán)）人: 葛龍海
• 主分類號(hào): C12N5/0789
• 分類號(hào): C12N5/0789;A61K35/44;A61K35/14;A61P27/02;A61P25/02;A61P9/10;A61P25/00;A61P25/28;A61P21/00;A61P3/10;A61P19/08
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1.一種分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒由A液、B液和C液組成，

A液：0.2-0.5mmol/L葛根素，0.3-1.0μmol/L?4-羥基肉桂酸苯乙酯，5-20mmol/LPBS，pH7.4；

B液：質(zhì)量/體積百分比濃度為8-15％的羥乙基淀粉溶液或質(zhì)量/體積百分比濃度為0.5-1.0％的甲基纖維素溶液；

C液：密度為1.077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液或密度為1.076g/mL的Percoll。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于：

A液：0.3-0.5mmol/L葛根素，0.5-0.8μmol/L?4-羥基肉桂酸苯乙酯，10-15mmol/LPBS，pH7.4；

B液：質(zhì)量/體積百分比濃度為10-15％的羥乙基淀粉溶液或質(zhì)量/體積百分比濃度為0.5-0.8％的甲基纖維素溶液；

C液：密度為1.077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液或密度為1.076g/mL的Percoll。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于：

A液：0.3mmol/L葛根素，0.5μmol/L?4-羥基肉桂酸苯乙酯，10mmol/L?PBS，pH7.4

B液：質(zhì)量/體積百分比濃度為10％的羥乙基淀粉溶液

C液：密度為1.077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液。

4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的分離人臍帶血干細(xì)胞的試劑盒的使用方法，包括如下步驟：

1)取含有10-50U/mL肝素的臍帶血與A液按2∶1的體積比混勻；

2)將步驟1)的溶液與B液按1∶1的體積混合，充分混勻，室溫靜置60-120分鐘；

3)用移液管移取上層細(xì)胞液至50mL離心管中；

4)將離心管置于離心機(jī)中，1000-2000rpm離心15-30分鐘，離心后棄去上清液，用生理鹽水清洗離心管，并用20-30mL生理鹽水重懸細(xì)胞沉淀；

5)將20-30mL?C液緩慢加入新的50mL離心管中，再將步驟4)得到的細(xì)胞液沿管壁緩慢加入C液上面，2000-3000rpm離心20-30分鐘；

6)離心后管內(nèi)可見分為四層：最上層是血漿，第二層為白膜層，主要含臍帶血干細(xì)胞，第三層為分離液層，第四層為粒細(xì)胞和紅細(xì)胞，用吸管輕輕插入，穿過血漿層至白膜層，沿管壁周緣吸出白膜層細(xì)胞，轉(zhuǎn)入另一50mL離心管中；

7)向步驟6)獲得的細(xì)胞液中加入5倍體積的生理鹽水，混勻，1000-2000rpm離心15-30分鐘，棄去上清液，將沉淀的細(xì)胞團(tuán)用生理鹽水清洗2次，得到人臍帶血干細(xì)胞。

5.一種人臍帶血干細(xì)胞治療液，其包含利用權(quán)利要求4的方法制備的人臍帶血干細(xì)胞。