[發明專利]一種人臍帶間充質干細胞的分離及血清梯度切換培養方法

無效

• 申請號: 201110444748.7
• 申請日: 2011-12-26
• 公開（公告）號: CN102533643A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 李力;肖揚
• 申請（專利權）人: 肖揚
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;莫瑤江

1.一種人臍帶間充質干細胞的分離及血清梯度切換培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

(a)取人臍帶用膠原酶II消化，直至Wharton膠全部消化，然后收集消化下來的單細胞，將單細胞接入α-MEM培養基中懸浮培養，直至細胞達到80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化；

(b)將胰蛋白酶消化的細胞懸液傳代接種于α-MEM培養基中懸浮培養，直至細胞達到80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化，再傳代接種于α-MEM培養基中懸浮培養，如此重復進行傳代培養，本步驟中的傳代培養的α-MEM培養基中的胎牛血清的濃度是隨傳代次數的增加而遞減直至無胎牛血清。

2.根據權利要求1所述的人臍帶間充質干細胞的分離及血清梯度切換培養方法，其特征在于，所述的步驟(b)為：將胰蛋白酶消化的細胞懸液傳代接種于胎牛血清體積分數為8％的α-MEM培養基中懸浮培養，直至細胞達到80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化，再傳代接種于胎牛血清體積分數為5％的的α-MEM培養基中懸浮培養，直至細胞達到80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化，再傳代接種于胎牛血清體積分數為2％的α-MEM培養基中懸浮培養，直至細胞達到80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化，再傳代接種于無胎牛血清的α-MEM培養基中懸浮培養，直至細胞達到80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化，然后一直用無胎牛血清的α-MEM培養基進行傳代培養。

3.根據權利要求1或2所述的人臍帶間充質干細胞的分離及血清梯度切換培養方法，其特征在于，步驟(a)中的膠原酶II的濃度為1g/L。

4.根據權利要求1或2所述的人臍帶間充質干細胞的分離及血清梯度切換培養方法，其特征在于，所述的步驟(b)中的胰蛋白酶消化的細胞懸液，其密度為2×10⁵～1×10⁶個/ml。

5.根據權利要求1或2所述的人臍帶間充質干細胞的分離及血清梯度切換培養方法，其特征在于，所述的步驟(b)中傳代接種的接種比例為1∶2～3，懸浮培養的條件都為：37℃、飽和濕度95％、體積分數為5％的CO₂的培養箱中培養，每3～4天全量換培養基一次。