[發(fā)明專利]新生裸鼠體內(nèi)擴增血液和骨髓干細胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110439836.8
• 申請日: 2011-12-25
• 公開（公告）號: CN102424814A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊寅柯;高紅;楊登科
• 申請（專利權(quán)）人: 楊寅柯;高紅;楊登科
• 主分類號: C12N5/0789
• 分類號: C12N5/0789
• 代理公司: 深圳市中知專利商標(biāo)代理有限公司 44101
• 代理人: 孫皓;林虹

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新生裸鼠體內(nèi)擴增血液和骨髓干細胞的方法。

背景技術(shù)

干細胞具備增殖和分化的特性。體外培養(yǎng)條件下，若不加入相應(yīng)的抑制因子(如白血細胞生成抑制因子等)，則細胞將很快分化成為不同類型的其它細胞而失去干細胞本身的特性。而其分化過程的調(diào)節(jié)，即由干細胞向特定的細胞分化的調(diào)控，目前仍是科學(xué)未能很好解決的問題。如何能使干細胞保持在未分化狀態(tài)，即仍具備干細胞的基本特征而又使細胞的量得以大量增殖，成為目前該研究領(lǐng)域的一大難題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種有效而簡便易行的擴增血液和骨髓干細胞的方法，以達到既能使干細胞數(shù)量的大量增加，又保持其多潛能分化的特征。

為解決上述問題，本發(fā)明提供一種新生裸鼠體內(nèi)擴增血液和骨髓干細胞的方法，其方法是以分離出的血液和骨髓干細胞制成懸浮液作新生裸鼠頭皮靜脈注射進行體內(nèi)擴增。

所述新生裸鼠為出生后≤24h，所述新生裸鼠的品種為BALB/c-nu。

所述分離出的血液和骨髓干細胞是采用Ficoll密度梯度離心法和磁力吸附分離法分步分離。

所述懸浮液是在血液和骨髓干細胞中加入生理鹽水制成。

所述懸浮液的濃度為10⁶-10⁷個干細胞/ml生理鹽水，注射劑量為0.05-0.1ml。

所述方法中，將懸浮液作新生裸鼠頭皮靜脈注射后，是待裸鼠生長15-60天后，再收集裸鼠血液。

所述方法中，收集裸鼠血液后，是采用Ficoll密度梯度離心法和磁力吸附分離法分步分離干細胞。

新生裸鼠由于具有很低的免疫排斥反應(yīng)，能很好地容納外來干細胞的生長，而隨著動物個體的長大，血液容量的增大，植入其體內(nèi)的細胞亦隨之大量增殖，而又由于動物體內(nèi)的內(nèi)環(huán)境的支撐和約束，干細胞在增殖的同時，能很好地保持其基本特性。本發(fā)明的注射劑量保持在合適劑量內(nèi)且注射干細胞也維持一定數(shù)量，能使血液和骨髓干細胞在裸鼠體內(nèi)保持持續(xù)的增殖，而且收集裸鼠血液的時間在15-60天范圍內(nèi)，既不會因為時間過短干細胞增殖不夠，也不會因時間過長導(dǎo)致分化。最終在收集的血液中檢測所獲干細胞活性＞90％：干細胞純度≥90％，內(nèi)毒素檢測＜5EU/kg。

本發(fā)明提供了一種動物體內(nèi)擴增血液和骨髓干細胞的方法，達到既保持干細胞基本特性的同時，又能使細胞數(shù)量大量增加的目的。該發(fā)明可以為臨床細胞治療提供性質(zhì)穩(wěn)定的干細胞，亦可為生物醫(yī)學(xué)研究提供可靠的細胞來源，能夠有效的緩解細胞供源不足的矛盾。

具體實施方式

本發(fā)明所用的實驗材料和試劑的廠家、型號如下所示：

裸鼠：出生≤24h的新生鼠，由美國Charles?River公司提供，品種為BALB/c-nu。

Ficoll液：Sigma公司產(chǎn)品，型號為F2637。

Diamond?CD34?Isolation?Kit：買自德國美天旎生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號為130-094-531，包括：連接有抗人CD34抗體的磁力小珠的緩沖液；洗柱緩沖液。

Diamond?CD133?Isolation?Kit：買自德國美天旎生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號為130-094-913，包括：連接有抗人CD133抗體的磁力小珠的緩沖液；洗柱緩沖液。

MACs磁力分離系統(tǒng)：買自德國美天旎生物技術(shù)有限公司，包括：磁力分離板；過濾柱。

現(xiàn)結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明：

實施例1

新生裸鼠體內(nèi)擴增血液和骨髓干細胞的方法，包括下列步驟：

(1)制備干細胞

采用Ficoll密度梯度離心法和磁力吸附分離法分步分離出CD34陽性的血液干細胞：取人新鮮全血10ml，加入50ml?0.5M的EDTA緩沖液中充分混合，取該混合液38ml加入50ml的離心管中，再由管底緩慢加入10ml?Ficoll液，于室溫下2000轉(zhuǎn)/分鐘離心25分鐘，小心吸取分界層的細胞約10ml，再用0.5M的EDTA緩沖液10ml洗細胞一次，細胞用連接有抗人CD34抗體的磁力小珠的緩沖液1ml懸浮，在冰上孵化20分鐘，將細胞混懸液在磁力分離板形成的磁力場中通過過濾柱，再用5ml緩沖液洗柱兩次，收集洗出液(含有要收獲的細胞)8到10ml，細胞計數(shù)板計數(shù)細胞量以供下一步的注射用。

(2)干細胞作新生裸鼠靜脈注射