[發明專利]一種全反式蝦青素含量測定方法

有效

• 申請號: 201110437754.X
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN102539611A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 龍祥;萬慶家;胡志祥;張秋玲;史曉晨;楊瑜
• 申請（專利權）人: 云南綠A生物工程有限公司
• 主分類號: G01N30/89
• 分類號: G01N30/89;G01N30/06
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 劉丹妮

技術領域

本發明涉及一種雨生紅球藻、雨生紅球藻提取物及雨生紅球藻制劑(含提取物制劑)中(3S，3′S)-全反式蝦青素含量的測定方法。

背景技術

蝦青素由中央多聚烯鏈和位于兩側的六元環組成，環上有α-羥基酮結構，是一種抗氧化能力很強的類胡蘿卜素。3位和3′位上的羥基可與脂肪酸成酯，蝦青素酯較游離蝦青素更穩定。

蝦青素的分子結構中含多個共軛雙鍵，存在272種可能的幾何異構體，常見的有四種：全反式、9Z、13Z、15Z，其中以全反式異構體最穩定。蝦青素的分子結構中3位和3′位為手性碳原子，蝦青素存在三種立體異構體(3S，3′S)、(3R，3′S)、(3R，3′R)，其構型影響其在體內的吸收、生物學功能和組織中的分布，其中以(3S，3′S)-全反式蝦青素穩定性最高，活性最強。具體性質見表1。

表1蝦青素的理化性質

雨生紅球藻(Haematococcus?pluvialis)屬于綠藻門(Chlorophyta)、綠藻綱(Chlorophyceae)、團藻目(Volvocales)、紅球藻科(Haematococcaceae)、紅球藻屬(Haematococcus)。營自養生活，運動細胞呈綠色，具2條頂生、等長、約等于體長的鞭毛，通過前端的叉狀膠質管伸出細胞壁；細胞由廣卵型到廣橢圓形，寬15～20μm，長20～25μm；原生質體呈卵形，色素體杯狀，成熟時呈網狀或顆粒狀；具有多個不規則排列的蛋白核，細胞壁和原生質體間由許多分枝或不分枝的細胞質連絲相連，伸縮泡多個，不規則地分散在原生質體內；儲藏物質為淀粉。遇不良環境，運動細胞失去鞭毛，原生質體變圓，膠被逐步消失，并形成厚厚的囊殼，成為厚壁孢子，直徑增大到25～50μm，其中積累大量的蝦青素而呈紅色、深紅色。雨生紅球藻粉(Haematococcus?algae)為雨生紅球藻經破壁、噴霧干燥或真空干燥而得的。目前，雨生紅球藻被公認為自然界中生產天然蝦青素的主要來源。

雨生紅球藻中的蝦青素大部分與脂肪酸結合成酯，其中以單酯占主導地位，少量以雙酯形態存在。雨生紅球藻中的大部分蝦青素與蝦青素酯為(3S，3′S)-全反式構型，其含量達到總蝦青素含量的75％以上。且在雨生紅球藻所有構型的蝦青素中也以全反式構型的含量最高、穩定性最高、活性最強，故測定(3S，3′S)-全反式蝦青素的含量對于有效評價及控制雨生紅球藻及其提取物及其制劑的質量具有重要意義。

目前檢測蝦青素含量的方法主要采用分光光度法或HPLC法對樣品中總蝦青素進行測定，所測得的含量為蝦青素的總含量，不能對其中占主導地位的含量高、穩定性高、活性強的(3S，3′S)-全反式蝦青素開展專屬性測定研究，檢測的準確性存在缺陷。

發明內容

本發明的目的是提供一種測定雨生紅球藻、雨生紅球藻提取物及雨生紅球藻制劑(含提取物制劑)中(3S，3′S)-全反式蝦青素含量的方法，以達到能準確檢測出樣品中占主導地位的(3S，3′S)-全反式蝦青素的含量，并且準確性高、針對性強。

本發明的目的是采用以下技術方案來實現的。

一種采用高效液相色譜法測定雨生紅球藻、雨生紅球藻提取物及雨生紅球藻制劑(含提取物制劑)中(3S，3′S)-全反式蝦青素含量的方法，該方法包括用二氯甲烷-正己烷溶液提取雨生紅球藻、雨生紅球藻提取物或制劑供試樣品，并進行水解，然后采用反相C18色譜柱，以丙酮-水作為流動相，通過梯度洗脫來測定雨生紅球藻、雨生紅球藻提取物或制劑供試樣品中(3S，3′S)-全反式蝦青素的含量。

優選地，所述洗脫條件包括以下步驟：

在0至8分鐘內流動相中所含丙酮的體積百分比為81％，水的體積百分比為19％；再于另外的15分鐘內丙酮的濃度由81體積％勻速變化至89體積％，水的濃度由19體積％勻速變化至11體積％。

優選地，所述雨生紅球藻、雨生紅球藻提取物或雨生紅球藻制劑(含提取物制劑)供試樣品的制備包括以下步驟：

1)以二氯甲烷-正己烷(7∶3)溶液提取樣品中的游離蝦青素及蝦青素酯，得到提取液；

2)將步驟1)得到的提取液以氮氣吹干后用丙酮溶解，然后添加體積比為0.2％的羧基酯脂肪酶溶液，在氮氣保護下進行酶水解處理，即可。

優選地，所述羧基酯脂肪酶溶液為0.2μg/mL的羧基酯脂肪酶溶液。

優選地，所述高效液相色譜法采用紫外檢測器，檢測波長為476nm。

優選地，所述流動相的流速為0.8mL/min。