[發明專利]一種苯并[a]芘降解酶及其分離方法

無效

• 申請號: 201110435916.6
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN102559620A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 豆俊峰;丁愛中;李帥冉;杜勇超;王鴻婷
• 申請（專利權）人: 北京師范大學
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;A62D3/02;B09C1/10;C02F3/00;C12R1/05;A62D101/20
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技術領域

本發明屬于生物工程技術與難降解有機污染物生物處理技術領域，特別涉及一種苯并[a]芘降解酶及其分離方法。?

背景技術

多環芳烴(Polycyclic?Aromatic?Hydrocarbons，PAHs)是一類含有兩個或兩個以上苯環的有毒有機污染物，具有強烈的致癌作用、致畸作用和致突變作用。PAHs能通過生物累積及食物鏈的傳遞作用對生態環境和人體健康造成極大危害，已引起各國環境科學家的高度重視。美國環保局早在80年代就已把16種未帶分支的PAHs確定為環境中的優先污染物，我國也把PAHs列入環境污染的黑名單中。?

目前對環境中多環芳烴的治理技術主要有物理法、化學法和生物法。物理處理技術主要存在處理費用高與去除不徹底的缺點。在化學法中國內外有學者利用有機溶劑(如乙醇、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮)及表面活性劑等洗脫環境中的多環芳烴，但會存在二次污染等問題。生物法具有操作簡單、運行費用低、無二次污染等優點。一般來說，隨著多環芳烴苯環數量的增加，其降解速率降低。因此，低分子量的多環芳烴在環境中能較快被降解，在環境中存在的時間較短，而高分子量的多環芳烴，例如苯并[a]芘、茚并[1，2，3-cd]芘等則難于降解，較長期存在于環境中。從降解微生物細胞中提取降解酶來強化降解已成為去除多環芳烴污染的一種重要方法。降解酶在多環芳烴降解的應用中具有降解效率高、作用底物濃度低及環境適應性強等優點，具有廣闊的應用前景。但是，由于對多環芳烴降解微生物缺乏深入的研究，國內外缺少高環多環芳烴降解酶方面的研究報道。?

發明內容

本發明提供一種苯并[a]芘降解酶及其分離方法。所述苯并[a]芘降解酶由產堿菌Alcaligenes?sp的菌液經過提取與純化得到的。該降解酶在進行降解苯并[a]芘時，適宜pH值為6.5～8.5，最適宜pH值為7.5，當pH值小于4及大于10時容易失活變性，適宜反應溫度為30～45℃，最適宜反應溫度為35℃，當溫度高于50℃易于失活變性，濃度為1mmol/L的Cu²⁺、Fe²⁺、Hg²⁺離子對降解酶活性有較強的抑制作用。?

分離苯并[a]芘降解酶所用的菌株產堿菌Alcaligenes?sp在2010年3月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，該中心位于北京市朝陽區北辰西路1號院中國科學院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC?NO.3638。從產堿菌Alcaligenes?sp中分離苯并[a]芘降解酶的具體方案為：?

①向加入198ml誘導培養基、2.0ml微量金屬液和0.2ml維生素c溶液的培養瓶內接種保?藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的菌株產堿菌Alcaligenes?sp；然后用透氣膜密封瓶口，將培養瓶在培養溫度為25～28℃、轉速為100r/min的振蕩器中培養30d后即可得到擴增培養后的菌液；?

②將步驟①中的菌液進行超聲波破碎15min；破碎后的菌液在8000r/min條件下離心15min，分離出菌體和上清液；?

③向由步驟②分離出的菌體中加入30ml去離子水，繼續進行超聲波破碎15min，在8000r/min條件下離心15min，分離出菌體和上清液；?

④向由步驟③分離出的菌體中加入30ml去離子水，繼續進行超聲波破碎15min，在8000r/min條件下離心15min，分離出菌體和上清液；?

⑤合并由步驟②、③和④所收集的上清液，即可得到苯并[a]芘降解酶粗提液；?

⑥向由步驟⑤得到的苯并[a]芘降解酶粗提液中加入碾細的(NH₄)₂SO₄固體至65～70％飽和度，在轉速為100r/min的振蕩器中振蕩1～2h，然后在8000r/min條件下離心15min，分離出沉淀；?

⑦將由步驟⑥得到的沉淀溶于少量pH值為7.0～7.2的0.05mol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖液并裝入透析袋中，將透析袋在pH值為7.0～7.2的0.05mol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖液中透析24h；將透析后的樣品在8000r/min條件下離心15min，分離出上清液；?