[發明專利]一種定量測定RNA和DNA濃度及其比值的方法

無效

• 申請號: 201110435760.1
• 申請日: 2011-12-22
• 公開（公告）號: CN102559879A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 安立會;鄭丙輝;張雷;宋雙雙;陳浩;趙興茹
• 申請（專利權）人: 中國環境科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 鄭小粵

技術領域

本發明是一種用于定量測定微生物、動植物組織和活體細胞中RNA濃度和DNA濃度及其比值的新方法，特別是使用熒光染料GelRed測定RNA濃度和DNA濃度及其比值的方法。該方法可用于環境生物樣品的分析測定。

背景技術

對生物樣品微量雙鏈DNA進行定量在各種生物學研究中非常重要，如核酸提取過程中的DNA和RNA定量、逆轉錄過程中RNA和cDNA濃度控制、建立cDNA文庫過程中RNA濃度和質量控制、用于判斷生物營養健康狀態的RNA和DNA比值以及藥物研發過程中對植物組織樣品中DNA定量等。

目前，測定生物組織DNA濃度和RNA濃度的方法主要采用光吸收法(紫外分光光度法)和染料法(熒光染料)。其中，紫外分光光度法快速便捷，對儀器沒有特殊要求并且對環境無污染，使用較廣。如最常用的檢測核酸濃度的方法就是檢測核酸在260nm(A₂₆₀)處的光吸收。但這種方法缺點在于單鏈核苷酸和單核苷酸會對吸光度產生干擾信號，并且核酸樣品中的蛋白等雜質也會影響光吸收。另外，光吸收不能區分DNA和RNA，靈敏度也相對較低(用1cm的比色杯在A₂₆₀值為0.1時對應的雙鏈DNA濃度為5μg/ml)。這在一定程度上限制了該方法在高靈敏度樣品測試中的應用。

染料法即利用某些熒光染料與DNA或RNA結合后發出的熒光強度來分析樣品中的DNA濃度和RNA濃度水平。溴化乙啶(EB)是目前使用最廣泛的核酸凝膠染色試劑，能夠在多數應用中提供可以接受的靈敏度(納克級)，但它是一種高誘變性的化學物質，對分析測試人員和環境具有致突變的毒害作用。并且EB染色后具有較高的背景熒光信號，對準確定量樣品中DNA濃度具有不利影響。而SYBR?Green?I染料雖然也具有較高的靈敏性，但這種染料在分析測試過程中的穩定性較差，導致與DNA或RNA結合穩定而影響分析結果。而近年在市場上新出現的染料如Hoechst染料和PicoGreen染料，雖然也具有非常高的靈敏度，但價格昂貴，造成分析測試的高成本，為一般實驗室難以承受。因此，需要開發一種對環境無污染且簡便、高效、靈敏檢測生物樣品中RNA濃度與DNA濃度及其比值的新方法。

發明內容

本發明的目的是為克服現有技術的不足而提供的一種定量測定RNA濃度和DNA濃度及其比值的方法，能夠靈敏、快速地同時測定生物組織或細胞中RNA濃度和DNA濃度及其比值。

為實現本發明目的而提供的一種定量測定RNA濃度和DNA濃度的方法，包括以下步驟：

a)配制DNA標準溶液、RNA標準溶液、GelRed染料溶液，并制備待測樣品溶液；

b)將獲得的DNA標準溶液、RNA標準溶液和待測樣品溶液分別與GelRed染料溶液混合；

c)將與GelRed染料溶液混合后的DNA標準溶液、RNA標準溶液、待測樣品溶液分別加入酶標板中；

d)分別測定所述酶標板中DNA標準溶液、RNA標準溶液和待測樣品溶液的熒光值；

e)根據所述DNA標準溶液、RNA標準溶液的熒光值制作熒光值-濃度的標準曲線，所建標準曲線的線性回歸方程為y＝ax+b，確定a，b值；

f)根據標準曲線計算所述待測樣品DNA濃度和RNA濃度。

本發明還提供了一種靈敏、快速地測定生物組織或細胞中RNA和DNA比值的方法，所述方法包括：

(1)采用本發明所述的方法測定RNA的濃度和DNA的濃度；

(2)確定RNA的濃度和DNA的濃度之間的比值。

本發明測定生物組織與細胞中RNA濃度和DNA濃度及其比值的方法，充分利用GelRed染料能夠與dsDNA、ssDNA或RNA結合，同時高靈敏度、低毒性并且穩定性的特性，簡便、高效、靈敏地檢測生物樣品RNA與DNA比值。與其它方法相比，該方法廢棄物可直接倒入下水道而不會造成環境污染，并且對實驗操作人沒有任何毒害作用；染料用量少，簡單經濟；方法靈敏度高，可以檢測生物樣品中ng級的RNA和DNA，對樣品的需要量少，從而大大降低了分析成本并提高了分析效率。本發明的方法為生物學相關研究提供了重要的分析技術，在生物、環境等領域研究具有廣泛的應用前景。本發明的分析方法還可以用于分析環境生物體內RNA和DNA比值判斷生物體健康狀況和營養條件以及環境污染對生態可能造成的影響。

下面結合附圖及具體實施例對本發明做進一步說明。

附圖說明

圖1為測定樣品DNA的標準曲線。

圖2為測定樣品RNA的標準曲線。

具體實施方式