[發(fā)明專利]IL-24和OSM雙基因共表達(dá)重組質(zhì)粒和重組腺病毒以及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110433101.4
• 申請日: 2011-12-21
• 公開（公告）號: CN102559753A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊吉成;繆競誠;劉濟(jì)生;盛偉華
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/861;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 常亮;李辰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體涉及IL-24和OSM雙基因共表達(dá)重組質(zhì)粒和重組腺病毒以及應(yīng)用。?

背景技術(shù)

近年來，惡性腫瘤中的皮膚惡性黑色素瘤以及鼻咽癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢。其中，皮膚惡性黑色素瘤(cutaneous?malignant?melanoma，CMM)是一種惡性程度很高的皮膚腫瘤，它的發(fā)生往往開始于那些色素沉著的部位，通常是由鑲嵌在表皮的基底細(xì)胞中的生黑素細(xì)胞不受細(xì)胞增殖機(jī)制控制衍生的。最近的一些報(bào)道顯示我國的發(fā)病率有逐漸增高的趨勢，由于對其嚴(yán)重性認(rèn)識不足，一般就診時(shí)往往已是晚期。而鼻咽癌(nasopharyngeal?carcinoma，NPC)是我國高發(fā)腫瘤之一，廣東、廣西、福建、湖南等省為國內(nèi)高發(fā)區(qū)。鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素作用、多基因參與、多階段病變發(fā)生的極其復(fù)雜的癌變過程，它的發(fā)病率和死亡率均隨年齡增長而上升，是人類健康的重大威脅。?

腫瘤是當(dāng)今社會影響人類健康的主要疾病之一，腫瘤的發(fā)生發(fā)展受體內(nèi)多種原因的調(diào)控，腫瘤抑制基因正是參與這一調(diào)控的重要分子。很多腫瘤中都有某些腫瘤抑制基因的失活，向缺失某種抑癌基因的細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入正常的抑癌基因，則可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的表型、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，從而達(dá)到治療目的，這種方法稱之為基因治療。基因治療作為一種高效性、特異性、靶向性的治療手段已是醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)，基因治療技術(shù)的出現(xiàn)為治療皮膚惡性黑色素瘤以及鼻咽癌指明了發(fā)展方向。?

現(xiàn)階段，已經(jīng)有多篇文章報(bào)道了有關(guān)抑制黑色素瘤以及鼻咽癌的基因，例如白細(xì)胞介素-24(IL-24)基因和抑瘤素(OSM)基因。白細(xì)胞介素-24(IL-24)又稱黑色素瘤分化相關(guān)因子-7(mda-7)，為分泌型細(xì)胞因子，是一種膜受體介導(dǎo)的腫瘤生長抑制因子，它是第一個(gè)既抑?制腫瘤細(xì)胞生長和血管形成并誘導(dǎo)其凋亡同時(shí)又能刺激免疫細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的新型抑癌基因。迄今為止已有許多實(shí)驗(yàn)證明IL-24具有顯著的抑制腫瘤的作用，能選擇性地抑制多種腫瘤生長，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，包括黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌等。這種抑制作用不依賴p53、Rb和p16等抑癌基因，且對正常細(xì)胞沒有影響。?

抑瘤素(OSM)是IL-6細(xì)胞因子家族的成員之一，是一種多功能的細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)基因活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化、調(diào)節(jié)免疫、參與炎癥反應(yīng)、重塑細(xì)胞外基質(zhì)、造血、神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)等多種功能，此外，OSM還能對多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用。?

將上述抑癌基因通過載體攜帶轉(zhuǎn)染或感染靶細(xì)胞，便可實(shí)現(xiàn)基因治療皮膚惡性黑色素瘤以及鼻咽癌，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的效果。基因治療中應(yīng)用的載體可分為兩類：非病毒式和病毒式。這兩者中病毒介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染效率高，目的基因表達(dá)穩(wěn)定，在現(xiàn)有的基因治療方案中占絕大多數(shù)。目前用于基因治療的常用病毒式載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒載體、單純皰疹病毒載體和嵌合病毒載體等。而本領(lǐng)域技術(shù)人員公知腺病毒載體與其它病毒載體相比較而言，有很多優(yōu)點(diǎn)，如1、宿主范圍廣，對人致病性低；2、具有感染率高、對分裂和非分裂細(xì)胞都能感染；3、能攜帶很長的治療基因和同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因；4、不整合到染色體中，無插入致突變性，安全性好；5、能有效進(jìn)行增殖，滴度高，易加工制備等。而采用腺病毒載體中的pAdEasy腺病毒表達(dá)系統(tǒng)更具許多特殊優(yōu)點(diǎn)：1.腺病毒質(zhì)粒的同源重組可在大腸桿菌BJ5183中高效進(jìn)行，且細(xì)菌繁殖快，同源重組能力強(qiáng)，因而從根本上克服細(xì)胞內(nèi)同源重組率低的缺陷；2.腺病毒中可插入11kb的基因片段或同時(shí)插入多個(gè)基因片段；3.由于在腺病毒骨架中含有的GFP報(bào)告基因，非常便于監(jiān)測病毒包裝成功與否、檢測病毒滴度及感染效率等。所有這些都避免了病毒的空斑克隆純化過程，大大減少了病毒的制備時(shí)間。?

雖然通過基因治療皮膚惡性黑色素瘤以及鼻咽癌有諸多優(yōu)點(diǎn)，但?是目前以腺病毒為載體同源重組IL-24基因或OSM基因后對腫瘤細(xì)胞的抑制作用不高，限制了基因治療技術(shù)在皮膚惡性黑色素瘤以及鼻咽癌中的應(yīng)用。?

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種雙基因共表達(dá)重組質(zhì)粒以及利用該重組質(zhì)粒制備的同源重組腺病毒，使得所述同源重組腺病毒對抑制黑色素瘤以及鼻咽癌的腫瘤細(xì)胞具有增效作用，同時(shí)對鼻咽癌腫瘤細(xì)胞的放療增敏具有增效作用。?

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：?

一種IL-24與OSM雙基因共表達(dá)重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-OSM，其保藏號為CCTCC?NO：M2011378。?