[發(fā)明專利]一種黃素酶親和介質(zhì)及其合成和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110425508.2
• 申請日: 2011-12-16
• 公開（公告）號: CN102513065A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 辛瑜;楊海麟;張玲;張玉然;陳亦;仝艷軍
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: B01J20/24
• 分類號: B01J20/24;B01J20/30;B01D15/42;C12N9/04;C12N9/02
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 王潔;顧小偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及醫(yī)療、診斷用酶生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種黃素酶親和介質(zhì)及其合成和應(yīng)用。

背景技術(shù)

自然界中存在大量輔酶依賴酶類，黃素酶是比較重要的一類，在眾多的生物反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用，如生物能量合成、氧化還原、生物發(fā)光、生物降解、染色體重構(gòu)、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)折疊、生物解毒作用、神經(jīng)發(fā)育、生物合成等。黃素酶類非常適用于使用生物催化的過程，具有較高的對映體及區(qū)域的選擇性，應(yīng)用潛力非常廣泛；其中，氧化酶類和單加氧酶類的研究最多，由于其底物和輔酶的高度特異性(包括對映體選擇性)，在醫(yī)藥工業(yè)、精細(xì)化工和食品工業(yè)中有很大的應(yīng)用潛力(見表1)。

表1?黃素氧化酶類和單加氧酶類的特性及應(yīng)用

長期以來，硫酸銨沉淀、三氯乙酸沉淀、透析、凝膠層析等傳統(tǒng)方法被用于葡萄糖氧化酶、硫辛酰胺脫氫酶、乳酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、黃嘌呤氧化酶、對苯二酚羥化酶等黃素酶的提取與制備；近二十年來，一些較為先進(jìn)的純化技術(shù)也被引入，如離子交換層析、羥基磷灰石層析、共價層析、藍(lán)染料層析、金屬離子親和層析等。總體而言，黃素酶種類繁多，各自的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)各不相同，制備的方法也各不相同，整體制備步驟復(fù)雜且回收率較低。

其中，金屬離子親和層析是基因工程菌表達(dá)重組蛋白酶純化的重要手段，但組氨酸標(biāo)簽的加入可能對目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重大影響。藍(lán)染料層析雖然對蛋白質(zhì)的吸附量比較大，但是藍(lán)染料分子本身具有較強(qiáng)的疏水性，非特異性吸附較強(qiáng)。

因此，需要提供一種黃素酶親和介質(zhì)，其分離黃素酶快速簡單高效，回收效率高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服了上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種黃素酶親和介質(zhì)及其合成和應(yīng)用，利用該黃素酶親和介質(zhì)可以大規(guī)模快速分離純化黃素酶，可在僅用一步親和層析的情況下，得到黃素酶純品，蛋白和活性回收率較高，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種黃素酶親和介質(zhì)，其特點(diǎn)是，所述黃素酶親和介質(zhì)由黃素酶親和配體和層析介質(zhì)連接而成。

較佳地，所述黃素酶親和配體是黃素輔酶核心構(gòu)件異咯嗪環(huán)的結(jié)構(gòu)類似物，所述層析介質(zhì)是Sepharose、殼聚糖、硅膠或陶瓷顆粒。

更佳地，所述的黃素輔酶核心構(gòu)件異咯嗪環(huán)的結(jié)構(gòu)類似物是乳清酸、胞嘧啶、7-氯異咯嗪或8-氯異咯嗪。

較佳地，所述黃素酶親和介質(zhì)由黃素酶親和配體和層析介質(zhì)通過環(huán)氧氯丙烷和乙二胺、1，3-丙二胺、2-羥基-1，3丙二胺或1，4-丁二胺作為間隔臂進(jìn)行連接。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種上述的黃素酶親和介質(zhì)的合成方法，其特點(diǎn)是，將所述黃素酶親和配體和所述層析介質(zhì)進(jìn)行連接得到。

較佳地，所述黃素酶親和介質(zhì)由黃素酶親和配體和層析介質(zhì)通過環(huán)氧氯丙烷和乙二胺、1，3-丙二胺、2-羥基-1，3丙二胺或1，4-丁二胺作為間隔臂進(jìn)行連接。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種利用上述的黃素酶親和介質(zhì)大規(guī)模純化黃素酶的方法，其特點(diǎn)是，將含有黃素酶的溶液流經(jīng)所述黃素酶親和介質(zhì)進(jìn)行親和吸附，然后采用清洗液沖洗所述黃素酶親和介質(zhì)，最后用洗脫緩沖液洗脫所述黃素酶親和介質(zhì)上吸附的黃素酶，從而純化黃素酶。

較佳地，所述黃素酶是膽固醇氧化酶或黃嘌呤氧化酶。

較佳地，所述親和吸附的條件為pH值6.5～7.5，電導(dǎo)率為5-10ms/cm。

較佳地，采用清洗液沖洗所述黃素酶親和介質(zhì)的清洗條件為pH值6.5～7.5，電導(dǎo)率5～10ms/cm。

較佳地，用洗脫緩沖液洗脫所述黃素酶親和介質(zhì)上吸附的黃素酶的洗脫條件為pH值2.8。

本發(fā)明的有益效果具體如下：

1、本發(fā)明通過采用黃素輔酶核心構(gòu)件異咯嗪環(huán)的結(jié)構(gòu)類似物作為黃素酶親和配體，與層析介質(zhì)連接合成黃素酶親和介質(zhì)，可快速高效純化黃素酶，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用；

2、本發(fā)明通過優(yōu)化蛋白質(zhì)吸附條件使得黃素酶的純化效率顯著增加，具有較大工業(yè)應(yīng)用潛力，體現(xiàn)出較大的經(jīng)濟(jì)效益。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的16種黃素酶親和介質(zhì)的間隔臂與親和配體的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是圖1所示的16種黃素酶親和介質(zhì)在處理與大腸桿菌破碎液混合后的膽固醇氧化酶及黃嘌呤氧化酶溶液的特異性吸附結(jié)果SDS-PAGE電泳圖，其中