[發明專利]高底物耐受性的磁性納米載體固定化醛縮酶的制備方法

無效

• 申請號: 201110417666.3
• 申請日: 2011-12-14
• 公開（公告）號: CN102517276A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 費輝;徐剛;吳堅平;楊立榮
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

技術領域

本發明涉及通過固定化提高酶的底物耐受性的方法，尤其涉及一種高底物耐受性的磁性納米載體固定化醛縮酶的制備方法。

背景技術

2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶因其可以催化兩個醛分子絡合而獨特于其它三種醛縮酶，且該酶寬松的專一性允許兩個底物的共取代，一些鏈長為四個氫原子以下的醛可作為受體，當第一個受體是取代的乙醛時，它可以和乙醛進行兩次連續的縮合，產物重排后得到穩定的環狀縮醛，可以繼續用于合成一些有用的藥物中間體。比如2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶可用于催化兩分子乙醛和另一個受體醛的羥醛縮合反應得到六氫吡喃結構，進而合成他汀類藥物中間體。

但是幾個重要問題限制了其在大規模生產中的實際應用。首先，催化劑投加量十分大，每克分離產物需要約200?mg?的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶，即20%的質量百分數。如此高的酶濃度使得合成費用昂貴并且增加了產物分離的困難；第二，反應時間需要幾天；第三，反應物濃度受限。各種因素綜合，只有2g/L/d?的體積產量，使得2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶的實際應用價值大大降低。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種高底物耐受性的磁性納米載體固定化醛縮酶的制備方法。

高底物耐受性的磁性納米載體固定化醛縮酶的制備方法的步驟如下：

1)?向250mL無氧水中加入0.25~0.35mol三價鐵鹽和0.15~0.2mol二價鐵鹽，以鹽酸調整至pH?=?1~2，超聲處理?30-40?min；升溫至?70~85?℃，在?1?200~?1?400?rpm?攪拌下，N₂?鼓泡?25~30?min，加入9~10?mL?質量百分數?25~28%的氨水或?10?~15mL?10mol/L?NaOH，使溶液?pH?=?8-10，20~30?min?后，磁分離，無氧水洗滌?5~10?次，再以?0.010~0.015mol/L?乙醇水溶液洗滌?3~4?次；

2)?加入80~100?mL體積百分數為50%的乙醇水溶液，6~8?mL硅烷交聯劑，50~60?℃、180~220?rpm攪拌?5~6?h，用pH?=?7的磷酸緩沖液洗滌3~5次；

3)?加入18~20?mL?pH?=?7的磷酸緩沖液及18~20?mL質量百分數5%的戊二醛水溶液，200?rpm攪拌2~3?h，磁分離，用pH?=?7?的磷酸緩沖液洗滌5次，真空干燥，得到表面活化的磁性納米粒子微球載體；

4）配制1mg/ml的醛縮酶蛋白溶液，醛縮酶蛋白與載體的質量比為：1:?1~5，在冰浴中，pH調整至5-10，200rpm，攪拌3-12h，磁分離，洗滌固定化酶，凍干，得到高底物耐受性的磁性納米載體固定化醛縮酶。用Bradford法檢測固定化反應剩余上清液的蛋白濃度；

5）將10mg固定化的醛縮酶300mM的乙醛溶液中保存2~12h，再加入到1ml的50mM?的三乙醇胺鹽酸鹽溶液，其pH為7.5，含0.1mmol?的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，?0.4mmol?的底物2-脫氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml?磷酸丙糖異構酶，11U/ml?甘油磷酸脫氫酶,?50℃條件下反應后檢測340?nm?處吸光度的變化

所述的二價鐵鹽為FeSO₄·7H₂O?或?FeCl₂·4H₂O。所述的三價鐵鹽為FeCl₃·6H₂O?或Fe₂(SO₄)₃·7H₂O。所述的硅烷交聯劑為氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷。所述的醛縮酶為Escherichia?coli?K12?AB200068。

本發明將磁性納米材料固定化醛縮酶用于催化2-脫氧-D-核糖-5-磷酸（DRP），得到?3-磷酸甘油醛和乙醛中，其底物耐受性有顯著提高，并且大大方便酶的回收和重復利用，具有極大的工業應用價值。

附圖說明

圖1磁滯曲線；

圖2表面活化的磁性納米粒子微球載體固定化醛縮酶酶掃描電子顯微鏡照片。

具體實施方式

高底物耐受性的磁性納米載體固定化醛縮酶的制備方法的步驟如下：