[發明專利]高底物耐受性的磁性納米載體固定化醛縮酶的制備方法

無效

• 申請號: 201110417666.3
• 申請日: 2011-12-14
• 公開（公告）號: CN102517276A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 費輝;徐剛;吳堅平;楊立榮
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

1.一種高底物耐受性的磁性納米載體固定化醛縮酶的制備方法，其特征在于它的步驟如下：

1)?向250mL無氧水中加入0.25~0.35mol三價鐵鹽和0.15~0.2mol二價鐵鹽，以鹽酸調整至pH?=?1~2，超聲處理?30-40?min；升溫至?70~85?℃，在?1?200~?1?400?rpm?攪拌下，N₂?鼓泡?25~30?min，加入9~10?mL?質量百分數?25~28%的氨水或?10?~15mL?10mol/L?NaOH，使溶液?pH?=?8-10，20~30?min?后，磁分離，無氧水洗滌?5~10?次，再以?0.010~0.015mol/L?乙醇水溶液洗滌?3~4?次；

2)?加入80~100?mL體積百分數為50%的乙醇水溶液，6~8?mL硅烷交聯劑，50~60?℃、180~220?rpm攪拌?5~6?h，用pH?=?7的磷酸緩沖液洗滌3~5次；

3)?加入18~20?mL?pH?=?7的磷酸緩沖液及18~20?mL質量百分數5%的戊二醛水溶液，200?rpm攪拌2~3?h，磁分離，用pH?=?7?的磷酸緩沖液洗滌5次，真空干燥，得到表面活化的磁性納米粒子微球載體；

4）配制1mg/ml的醛縮酶蛋白溶液，醛縮酶蛋白與載體的質量比為：1:?1~5，在冰浴中，pH調整至5-10，200rpm，攪拌3-12h，磁分離，洗滌固定化酶，凍干，得到高底物耐受性的磁性納米載體固定化醛縮酶，用Bradford法檢測固定化反應剩余上清液的蛋白濃度；

5）將10mg固定化的醛縮酶300mM的乙醛溶液中保存2~12h，再加入到1ml的50mM?的三乙醇胺鹽酸鹽溶液，其pH為7.5，含0.1mmol?的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，?0.4mmol?的底物2-脫氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml?磷酸丙糖異構酶，11U/ml?甘油磷酸脫氫酶,?50℃條件下反應后檢測340?nm?處吸光度的變化。

2.根據權利要求?1?所述的一種高底物耐受性的磁性納米載體固定化醛縮酶的制備方法，其特征在于所述的二價鐵鹽為FeSO₄·7H₂O?或?FeCl₂·4H₂O。

3.根據權利要求?1?所述的一種高底物耐受性的磁性納米載體固定化醛縮酶的制備方法，其特征在于所述的三價鐵鹽為FeCl₃·6H₂O?或Fe₂(SO₄)₃·7H₂O。

4.根據權利要求?1?所述的一種高底物耐受性的磁性納米載體固定化醛縮酶的制備方法，其特征在于所述的硅烷交聯劑為氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷。

5.根據權利要求?1?所述的一種高底物耐受性的磁性納米載體固定化醛縮酶、的制備方法，其特征在于所述的醛縮酶為Escherichia?coli?K12?AB200068。