[發明專利]一種光滑假絲酵母菌PCR檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201110415764.3
• 申請日: 2011-12-13
• 公開（公告）號: CN102409106A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 何華東;黃發平
• 申請（專利權）人: 泰普生物科學（中國）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/72
• 代理公司: 福州市鼓樓區博深專利代理事務所(普通合伙) 35214
• 代理人: 林志崢

技術領域

本發明涉及微生物檢測領域，具體涉及一種光滑假絲酵母菌菌株PCR檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

近年來，由于廣譜抗生素的廣泛應用，腫瘤化療、器官移植的開展以及免疫力低下患者尤其是艾滋病患者的增多，由真菌尤其是念珠菌引起的深部感染機會日益增多。

念珠菌屬于真菌界-半知菌亞門-芽孢菌綱-隱球酵母目-隱球酵母科。是雙相型單細胞酵母菌。念珠菌是一種芽生的酵母狀真菌，一種典型的條件致病菌。已知可以致病的常見念珠菌有：白念(candidaalbican)、熱帶(Candida?tropicalis)、近平滑(Candida.parapsilosis)、克魯斯(Candida?krusei)、星狀(Candidastellatoidea)、季也蒙(Candida?guilliermondii)和光滑念珠菌(Candida.glabrata)等八種在人體中，無癥狀時常表現為酵母細胞型；侵犯組織和出現癥狀時常表現菌絲型。

念珠菌是一種腐物寄生菌，廣泛存在于自然界。是人體正常菌群之一，平時主要生存于人體的口腔、皮膚、粘膜、消化道、陰道及其他臟器中。正常人群白色的帶菌率可高達40％；從陰道粘膜分離出來的念珠菌85％～90％為白色，而白色念珠菌(candida?albican)的致病性最強。

白色念珠菌(簡稱白念，Candida?albicans，CA)、熱帶假絲酵母菌(簡稱熱帶，Candidatropicalis，CT)和光滑假絲酵母菌菌(簡稱光滑，Candida?glabrata，CG)是其中的主要致病菌，其分布廣泛，感染類型多樣，已成為臨床抗感染治療的難點。

目前臨床應用的念珠菌的檢測方法有以下幾種：

常規涂片鏡檢是最基本的細菌學檢查方法。其優點是簡便、快速和價廉，當天出結果；缺點是敏感性低，特異性差，無法辨別死菌與活菌。通常需用科瑪嘉念珠菌顯色培養基進一步證實。

沙氏培養基是念珠菌感染診斷較為常用的培養基，但臨床上念珠菌感染癥有的為混合感染，不同的念珠菌在沙氏培養基上生長均呈現白色菌落，要進一步鑒定不同的菌種，有時還必須要做念珠菌的發酵試驗和芽管試驗，給實驗室的診斷帶來很大的不便。

科瑪嘉(CHROMagar)培養基培養法，該培養基含有特殊顯色物質，無需通過任何儀器，僅通過觀察菌落顏色即能在24～48小時(大多為48小時，30～37℃)用肉眼對念珠菌等進行定性和定量分析。但是培養所用的時間相對較長，不利于快速診斷。

另外，隨著儀器分析技術的進步和計算機的廣泛應用，微生物菌種鑒定逐漸由傳統的形態學觀察和人工生理生化實驗鑒定發展進入了基于儀器自動化分析的鑒定系統階段。如Biolog微生物自動分析系統、API?20C、ATB?32C、VITEK?YBC和API?Candid系統等。這些快速鑒定系統大多數是應用于臨床酵母菌的鑒定，如假絲酵母屬、隱球酵母屬等，針對性較強，能鑒定的酵母菌種類較少，其中API?20C能鑒定的酵母菌種類為37種，ATB?32C能鑒定的酵母菌種類為69種。雖然，目前我國已累計引進Biolog微生物自動分析系統有100余臺，但主要是應用于細菌的鑒定分析，應用于酵母菌鑒定的研究成果很少。

乳膠凝集反應、放免測定以及酶聯免疫吸附測定，也可以作為念珠菌的輔助檢測手段，但它們的敏感性和特異性均較差。

RAPD分型法，又稱任意引物聚合酶鏈反應(Arbitrarily?primedPCR)，AP-PCR)，是一種以PCR為基礎揭示基因組多態性的方法。該法采用隨機合成的單個寡核苷酸引物。在未知模板DNA序列情況下，以低退火溫度與基因DNA兩條鏈的多個非特異位點通過錯配而復性，擴增產物經瓊脂凝膠電泳分離產生指紋圖譜。由于不同種細菌或同種細菌的不同菌株與引物結合的退火點的親和性、數量和位置不同，所產生的指紋圖譜均有各自的特征，以此反映種系發育過程中的相互聯系及不同克隆間的差異。

該方法目前在日常醫院感染的監測與預防控制中占主導地位，但存在分辨率低、影響因素多、重復性較差等諸多不足。

發明內容

本發明目的是采用聚合酶鏈式反應及分子信標熒光探針技術對光滑假絲酵母菌基因中高保守特異性核酸序列進行擴增檢測，從而判斷光滑假絲酵母菌的存在，對光滑假絲酵母菌感染的輔助診斷。

本發明的技術方案為提供一種光滑假絲酵母菌PCR檢測試劑盒，包括PCR反應液，所述PCR反應液包括引物和熒光探針，所述引物分為上游引物A和下游引物A；