[發明專利]一種制備固定化腈水解酶的方法

無效

• 申請號: 201110414276.0
• 申請日: 2011-12-13
• 公開（公告）號: CN102517274A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 周小華;張杰;康宏寬;王丹;徐溢;王穎利
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術領域

本發明屬于固定化酶技術領域，具體涉及以市售賴氨酸-大孔離子交換樹脂為載體，制備固定化腈水解酶的方法。

二、背景技術

固定化酶是一種新型生物催化劑，是水溶性酶經物理或化學方法處理后，束縛于水不溶性載體的、具有酶催化特性的酶衍生物。與只能使用一次的游離酶相比較，固定化酶既具有游離酶的催化特性，又具有穩定性好、可反復利用等優點，還可實現生產工藝的連續化、自動化，是生物催化劑的主要發展方向。腈水解酶是一種具有廣泛底物適應性的生物催化劑，可催化腈水解生成相應的羧基酸，實現一般化學反應不具備的化學、區域和立體選擇性，用于制備手性化合物產品；也用于紡織品整理工藝，能改善織物的外觀與手感；此外，在降解腈類農藥方面的應用相當廣泛。

現有的制備固定化腈水解酶的工藝，例如2011年7月13號公開的公開號為CN102120994的“一種腈水解酶產生菌的細胞固定化方法”專利，公開的方法是：先制備出腈水解酶產生菌菌液，再經離心、洗滌、滅菌、固定化而制備出產品。該方法的主要缺點是：以細胞作為固定化載體，固定化腈水解酶分布于細胞內，由于死亡細胞沒有發達的孔穴，物質傳遞阻力大，酶反應速度低；細胞的剛性也差，易破碎，半衰期短；加之細胞體積小，難與溶液分離。因此，該固定化酶的應用效果差、成本高，不利于可持續發展。

三、發明內容

本發明的目的是針對現有制備固定化腈水解酶工藝的不足之處，提供一種制備固定化腈水解酶的方法，該方法具有反應條件溫和，酶活力回收較高，固定化酶半衰期長，操作簡單，成本較低，清潔安全，保護環境等特點。

本發明的原理是：經賴氨酸修飾的大孔離子交換樹脂，通過交聯劑戊二醛分別與賴氨酸殘基及酶表面的氨基反應，形成固定化酶。

實現本發明的目的技術方案是：一種制備固定化腈水解酶的方法，以市售腈水解酶為原料，以市售賴氨酸-大孔離子交換樹脂為載體，經固定、抽濾、洗滌的簡單工藝，制備出固定化腈水解酶產品。其具體的方法步驟如下：

(1)腈水解酶的預處理

以市售腈水解酶為原料，按照市售腈水解酶的質量(g)∶緩沖溶液的體積(mL)比為1∶8～10的比例，將市售腈水解酶加入到緩沖溶液中，攪拌溶解30～40分鐘后再泵入抽濾機中，進行抽濾，分別收集抽濾液和抽濾渣。對于收集的抽濾液，用于制備固定化腈水解酶；對于收集的抽濾渣，烘干后用做添加動物飼料。其中，所述的緩沖溶液為pH值為8～11的pH?8.0的硼砂-氯化鈣緩沖溶液或pH?9.0的硼砂-氯化鉀緩沖溶液或pH?10.8的硼砂-碳酸鈣緩沖溶液。

(2)制備固定化腈水解酶粗品

第(1)步完成后，按照市售賴氨酸-大孔離子交換樹脂載體的質量(g)∶第(1)步收集的抽濾液的體積(mL)∶戊二醛質量濃度為25％的戊二醛溶液的體積(mL)比為1∶2～3∶0.5～0.8的比例，先將賴氨酸-大孔離子交換樹脂載體加入緩沖溶液中，浸泡2～3小時，再加入第(1)步收集抽濾液和戊二醛溶液，攪拌均勻后，升溫至30～45℃，恒溫反應6～7小時，進行固定化酶反應。反應完成后通過抽濾機進行抽濾，分別收集抽濾渣和抽濾液。對于收集的抽濾渣，即為制備固定化腈水解酶粗品，用于下一步制備固定化腈水解酶；對于收集的抽濾液，用于再生處理。其中，所述的緩沖溶液為pH值為8～11的pH?8.0的硼砂-氯化鈣緩沖溶液或pH?9.0的硼砂-氯化鉀緩沖溶液或pH?10.8的硼砂-碳酸鈣緩沖溶液。

(3)制備固定化腈水解酶

第(2)步完成后，按照第(2)步收集的抽濾渣的質量(g)∶蒸餾水的體積(mL)之比為1∶4～5的比例，用蒸餾水對抽濾渣進行洗滌，除去夾雜的游離腈水解酶和戊二醛，分別收集洗滌渣和洗滌液。對于收集的洗滌渣，即為制備出的固定化腈水解酶，放置于4～6℃下保存備用；對于收集的洗滌液，泵入生化處理池、進行生化處理，達標后排放。

(4)再生處理

第(3)步完成后，將第(2)步收集的抽濾液，泵入截留分子量為1000～5000Da的納濾器中，在壓力為0.1～0.4MPa的條件下，進行納濾，除去腈水解酶的硼砂緩沖溶液，直至納濾截留液體積減少至原體積的10～30％時止，分別收集納濾濾過液和納濾截留液。對于收集的納濾濾過液即為回收的緩沖溶液，經調節pH值后可再次用于第(1)步溶解市售腈水解酶；對于收集的納濾截留液，泵入生化處理池、進行生化處理，達標后排放。

本發明主要有以下效果：