[發(fā)明專利]一種腺病毒載體及其在制備HCV細(xì)胞和小鼠模型中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110411318.5
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN102517330A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周育森;周小軍;孫世惠;趙光宇;郭彥
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N5/10;C12Q1/02;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種腺病毒載體及其在制備HCV細(xì)胞和小鼠模型中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

丙型肝炎病毒(hepatitis?C?virus，HCV)是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要因素之一，嚴(yán)重威脅人類健康。目前尚沒有有效的HCV預(yù)防性疫苗，而HCV模型，尤其是感染性模型的缺乏，也阻礙了HCV疫苗研發(fā)及致病機(jī)制研究，從而增加了其防控難度。現(xiàn)有的HCV感染性小鼠模型主要是免疫缺陷型人肝嵌合小鼠，不能用于HCV疫苗評價(jià)及致病機(jī)制研究。(Mercer?DF，Schiller?DE，Elliott?JF，Douglas?DN.，Hao?C，RinfretA，Addison?WR，F(xiàn)ischer?KP，Churchill?TA，Lakey?JR，Tyrrell?DL，Kneteman?NM.Hepatitis?Cvirus?replication?in?mice?with?chimeric?human?livers.Nat?Med?2001；7：27-933.)。

第三代腺病毒載體，又稱空殼載體或輔助病毒依賴型腺病毒(HDAd，helper-dependent?adenovirus)載體，它去除了腺病毒全部的編碼反式作用蛋白的基因，僅保留了兩端的反向末端重復(fù)序列以及包裝信號，其去除的腺病毒蛋白編碼序列的功能由輔助病毒提供。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種重組腺病毒載體。

本發(fā)明提供的重組腺病毒載體，為將序列表中序列1所示的核苷酸插入腺病毒載體HDAd中得到的載體。

上述重組腺病毒載體具體為將序列表中序列1所示的核苷酸插入腺病毒載體HDAd的I-Ceu?I和I-Sce?I位點(diǎn)間得到的載體。

由上述重組腺病毒載體包裝得到的腺病毒。

上述腺病毒為將上述重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染表達(dá)Cre重組酶的293細(xì)胞，包裝得到的腺病毒。

上述腺病毒具體按照如下方法制備：將上述重組腺病毒載體經(jīng)Pme?I線性化后與輔助病毒AdNG163共轉(zhuǎn)染表達(dá)Cre重組酶的293細(xì)胞，包裝得到腺病毒。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，為將上述腺病毒導(dǎo)入宿主細(xì)胞中得到的細(xì)胞。

上述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中，所述宿主細(xì)胞為Huh7細(xì)胞。

上述的重組腺病毒載體或上述的腺病毒在制備篩選抗HCV藥物的細(xì)胞模型中的應(yīng)用。

上述的重組腺病毒載體或上述的腺病毒在制備用于篩選抗HCV藥物小鼠模型中的應(yīng)用。

上述的重組腺病毒載體或上述的腺病毒或上述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在篩選抗HCV藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供了一種重組HCV?2a型JFH1全長基因組的第三代腺病毒載體，其制備得到的腺病毒可以用來制備HCV全基因組細(xì)胞模型或小鼠模型，得到的模型可以用來進(jìn)行抗HCV藥物篩選，從而用于HCV疫苗評價(jià)及致病機(jī)制研究。

附圖說明

圖1為HDAd-HCV病毒感染Huh7細(xì)胞GFP及HCV?core和NS3免疫熒光檢測結(jié)果。

圖2為HDAd-HCV病毒感染Huh7細(xì)胞HCV?core和NS3?Western?blot檢測結(jié)果。

圖3為HDAd-HCV病毒感染Huh7細(xì)胞HCV?RNA?Northern?blot檢測結(jié)果。

圖4為HDAd-HCV病毒感染Huh7細(xì)胞及上清中HCV?RNA實(shí)時(shí)定量檢測結(jié)果。

圖5為HDAd-HCV病毒感染Huh7細(xì)胞培養(yǎng)上清再感染Huh7細(xì)胞HCV?core和NS3免疫熒光檢測結(jié)果。

圖6為HDAd-HCV病毒感染Huh7細(xì)胞培養(yǎng)上清HCV感染性被人CD81單克隆抗體阻斷實(shí)驗(yàn)。

圖7為HDAd-HCV病毒感染Huh7細(xì)胞培養(yǎng)上清HCV感染性被HCV?E2單克隆抗體阻斷實(shí)驗(yàn)。

圖8為HDAd-HCV病毒感染Huh7細(xì)胞透射電鏡及上清針對HCV?E2的免疫電鏡結(jié)果。

圖9為HDAd-HCV病毒感染Huh7細(xì)胞模型用于IFN-α抗HCV作用評價(jià)。

圖10為HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠肝組織HCV?core和NS3Western?blot檢測結(jié)果。

圖11為HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠肝組織HCV?RNA?Northern?blot檢測結(jié)果。

圖12為HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠血清HCV?RNA實(shí)時(shí)定量檢測結(jié)果。