[發明專利]一種獲得紅霉素鏈霉菌高產菌株的方法

無效

• 申請號: 201110411021.9
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN103160445A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 李瑾;程傳東;何海燕;張麗麗;于新令;王鳳灘
• 申請（專利權）人: 山東方明藥業集團股份有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/01;C12N13/00;C12N1/21;C12N15/03;C12R1/465
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1.采用紫外線照射誘變選育紅霉素鏈霉菌高產菌株Ⅰ，其步驟是：

（1）篩選出發菌株：選取效價較高且穩定的紅霉素鏈霉菌作為出發菌株；

（2）紫外線照射誘變：將出發菌株制備成孢子懸液進行紫外線照射誘變，稀釋后涂布于培養皿上培養；

（3）篩選高產菌株：隨機挑選若干誘變后長出的菌株，制備母斜面，培養成熟后接搖瓶進行發酵培養，測定其效價；

（4）遺傳穩定性考察：對篩選得到的高產菌株進行多次傳代試驗，搖瓶考察其遺傳性狀的穩定性，最終篩選得到高產且穩定的菌株。

2.采用快中子照射誘變選育紅霉素鏈霉菌高產菌株Ⅱ，其步驟是：

（1）篩選出發菌株：選取效價較高且穩定的紅霉素鏈霉菌作為出發菌株；

（2）快中子照射誘變：將出發菌株制備成孢子懸液進行快中子輻射誘變，稀釋后涂布于培養皿上培養；

（3）篩選高產菌株：隨機挑選若干誘變后長出的菌株，制備母斜面，培養成熟后接搖瓶進行發酵培養，測定其效價；

（4）遺傳穩定性考察：對篩選得到的高產菌株進行多次傳代試驗，搖瓶考察其遺傳性狀的穩定性，最終篩選得到高產且穩定的菌株。

3.采用原生質體融合技術將權利要求1和權利要求2中獲得的高產菌株Ⅰ和Ⅱ進行融合，獲得新的高產重組子，其步驟是：

（1）孢子懸液的制備：將權利要求書1和2中所得到的高產菌株Ⅰ和Ⅱ分別制備成孢子懸液；

（2）菌體的培養：取適量孢子懸液接入種子瓶內，在適宜條件下將菌體培養至對數生長期；

（3）原生質體的融合：將權利要求1和2中得到的高產菌株進行原生質體融合，包括原生質體的分離、融合及再生；

（4）篩選高產菌株：隨機挑選若干誘變后長出的菌株，制備母斜面，培養成熟后接搖瓶進行發酵培養，測定其效價；

（5）遺傳穩定性考察：對初篩的高產菌株進行多次傳代試驗，考察其遺傳性狀的穩定性，最終篩選到高產且穩定的菌株；

（6）發酵罐試驗：將所篩選的高產菌株進行發酵罐試驗，測定其效價。

4.根據權利要求1所述的采用紫外線照射誘變獲得紅霉素鏈霉菌高產菌株的方法，其特征在于：所述的紫外照射條件為15W、30cm照射90s。

5.根據權利要求2所述的采用快中子照射誘變獲得紅霉素鏈霉菌高產菌株的方法，其特征在于：所述的快中子輻射劑量為6×10¹¹N/cm²。

6.根據權利要求3所述的采用原生質體融合的方式將兩株高產菌株融合獲得新的高產重組子的方法，其特征在于：溶菌酶濃度為2.5mg/ml，34℃，酶解1h；熱滅活溫度為60℃，時間為10min；紫外滅活照射條件為15W、30cm照射150s。

7.根據權利要求1、要求2和要求3中所述的紅霉素鏈霉菌高產菌株的初篩和復篩方法，其特征在于：利用搖瓶發酵培養測定紅霉素效價的方式來篩選高產菌株，所用斜面培養基為：可溶性淀粉6g，玉米漿7g，硫酸銨3g，氯化鈉3g，瓊脂粉20g，加水定容至1000ml，調pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g；種子瓶培養基配方為：玉米淀粉28g，糊精7g，中溫黃豆餅粉12.6g，硫酸銨1.2g，硝酸銨1.2g，氯化鈉3g，玉米漿7.1g，分析純碳酸鈣6g，豆油2ml，加水定容至1000ml，調pH值至7.0；發酵瓶培養基配方為：玉米淀粉18g，糊精24g，中溫黃豆餅粉18g，硫酸銨2g，輕質碳酸鈣6g，豆油4ml，加水定容至1000ml，調pH值至7.0。

8.根據權利要求3所述的發酵罐試驗的方法，其特征在于：所用種子罐培養基配方為：玉米淀粉15g，糊精30g，黃豆餅粉15g，氯化鈉2g，硫酸銨1.2g，玉米漿3g，輕質碳酸鈣8g，豆油5ml，消沫劑0.3ml；發酵罐培養基為：玉米淀粉30g，糊精10g，黃豆餅粉30g，氯化鈉2g，硫酸銨1.8g，玉米漿13g，輕質碳酸鈣8g，豆油5ml，消沫劑0.3ml。