[發明專利]一種重組酶基因、雙元表達載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201110403691.6
• 申請日: 2011-12-07
• 公開（公告）號: CN102443574A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: 張興國;蘇承剛;杜小兵;陳吉裕;張香琴;宋波
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/52;C12N15/63;C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 周韶紅

1.一種重組酶，其特征在于：它為ntCre基因，其具有如SEQ?ID?No.1序列。

2.如權利要求1所述重組酶的制備方法，其特征在于：

用引物SEQ?ID.4和引物SEQ?ID.NO.5、PrimStar?HS?DNA聚合酶從大腸桿菌菌株BM25.8基因組DNA中PCR擴增出1040?bp大小的源自P1噬菌體的Cre基因(GenBank?accession?X03453），反應條件為：95℃預變性2?min，95℃變性10?sec，50℃退火20?sec，72℃延伸1?min?10?sec，3個循環，95℃變性10?sec，60℃退火20?sec，72℃延伸1?min?10?sec，27個循環，最后72℃延伸10?min；用Taq?DNA聚合酶加“A”尾后，TA克隆進T載體pMD18-T，轉化大腸桿菌XL1-Blue感受態細胞，Amp抗性重組子經PCR擴增篩選，引物為SEQ?ID.NO.6和SEQ?ID.NO.7，PCR反應條件為：94℃預變性3?min，94℃變性20?sec，52℃退火20?sec，72℃延伸1?min，35個循環，最后72℃延伸10?min，電泳檢測得到預期898?bp大小的產物，測序結果顯示所克隆的基因同GenBank中公布的序列，得到陽性克隆載體pVCT1251和重組酶Cre基因；用Xba?I和Nco?I酶切載體pVCT1251，回收3727?bp片段，棄11?bp片段；

將合成的序列SEQ?ID.NO.8和合成的序列SEQ?ID.NO.9于94℃變性3分鐘后退火，構成含有擬南芥At4g01735基因內含子和猴SV40病毒外殼蛋白T抗原核定位信號的編碼序列的Xba?I-Nco?I接頭；將回收片段與接頭用T4?DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌XL1-Blue感受態細胞，Amp抗性重組子經PCR擴增篩選，引物為SEQ?ID.NO.10和SEQ?ID.NO.11，?PCR反應條件為：94℃預變性3?min，94℃變性20?sec，55℃退火20?sec，72℃延伸30?sec，35個循環，最后72℃延伸10?min，電泳檢測得到293?bp預期大小產物，得到陽性克隆載體pVCT1252，使重組酶Cre基因上游帶上第一內含子和具有核定位信號編碼的序列；

用Xba?I和Sac?I酶切載體pVCT2027，回收3106?bp片段，棄1889?bp片段；

用Xba?I和Sac?I酶切載體pVCT1252，回收1096?bp片段，棄17?bp和?2669?bp片段；將兩個片段用T4?DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌XL1-Blue感受態細胞，得Amp抗性重組子，用分別位于熱激啟動子HSP70m上游的LacZ上和位于Cre基因下游的引物SEQ?ID.NO.5進行PCR擴增篩選,得1315?bp預期大小產物，再經酶切和測序鑒定，得到陽性克隆載體pVCT2136；

用EcoRV酶切載體pVCT2136，電泳回收4196?bp片段；采用PCR方法，用引物5’-gtaaatttctagtttttctccttc-3’?(位于內含子上游)和引物5’-ctgtaactatcatcatcatcatag-3’?(位于內含子下游)、PrimStar?HS?DNA聚合酶（TaKaRa，日本）從pCAMBIA1301載體DNA中擴增出190?bp大小的內含子序列，并電泳回收；將回收片段純化后用T4?DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌XL1-Blue感受態細胞，得Amp抗性重組子，用分別位于Cre基因兩端的引物SEQ?NO.4和SEQ?ID.NO.5(位于ntCre基因下游)進行PCR擴增鑒定和測序驗證，得到陽性克隆載體pVCT2117和預期的ntCre基因。

3.含權利要求1所述重組酶的植物雙元表達載體，其特征在于：所述植物雙元表達載體的T-DNA結構包括RD29A::ntCre::Tnos基因和LoxP序列；其中RD29A為重組酶ntCre的低溫誘導特異性啟動子，LoxP為重組酶ntCre的識別位點、切割和重組的序列。

4.如權利要求3所述的植物雙元表達載體，其特征在于：所述的植物雙元表達載體為pVCT2221，其T-DNA結構的主要構建元件包括：LB、T35s、LoxP、nptIIm、Pnos、Tnos、ntCre、RD29A、35S、mGFP和RB序列。