[發明專利]一種富馬酸生產方法

有效

• 申請號: 201110401574.6
• 申請日: 2011-12-06
• 公開（公告）號: CN102399829A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 鄧利;劉珞;宋嘉寧;王芳;譚天偉
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12P7/46
• 分類號: C12P7/46;C12N15/52;C12N15/63;C12N9/00
• 代理公司: 北京康盛知識產權代理有限公司 11331
• 代理人: 張良

發明領域

本發明屬于生物化工領域，特別涉及一種富馬酸的生產方法。

背景技術

富馬酸又名延胡索酸，學名反丁烯二酸。外觀為白色、無氣味的結晶粉末，有水果酸味，其酸味約為檸檬酸的1.5倍，可燃，在空氣中穩定。富馬酸是一種含有雙鍵的二元羧酸，作為重要的有機化工原料和精細化工產品，廣泛應用于食品及飼料添加劑、材料(樹脂、涂料及增塑劑等)、醫藥、化工等領域。同時富馬酸還是一種重要的四碳平臺化合物，可以通過氨化、水合、加氫及異構等工藝生產L-天冬氨酸、琥珀酸、1，4-丁二醇、馬來酸等四碳化合物，因此被美國能源部列為優先發展的12種平臺化合物之一。

當前工業上主要采用順酐(又稱馬來酸酐)異構法生產富馬酸，其他可以用來生產富馬酸的工藝還包括：糠醛氧化法、馬來酸酶催化異構法、石蠟發酵法(又稱假絲酵母發酵法)以及生物質原料發酵法等。富馬酸的生產方法中順酐異構法、馬來酸酶催化異構法及石蠟發酵法采用的原料均為石油基產品，隨著石油的枯竭及油價的大幅上漲，這些工藝不符合當前可持續發展的要求，且產品的市場競爭力越來越差。糠醛氧化法的原料雖說可以來自生物質原料，但該工藝的產品收率低、催化劑毒性大，不符合當前綠色環保的時代要求。生物法生產富馬酸可以極大縮減原材料成本，避免化學法合成富馬酸所帶來的環境污染問題；通過代謝調控、基因改造、酶工程等手段是提高生物法生產富馬酸的產率重要思路。正是由于這些原因，使得以可再生生物質為原料發酵生產包括富馬酸在內的各種平臺化合物成為各國政府今后發展的重點方向之一。20世紀初期就開始了霉菌發酵產富馬酸的研究工作，隨著科學技術的進步，富馬酸得率一度到了30％-40％。

富馬酸的生物合成法具體包括酶催化轉化法和微生物發酵法。20世紀90年代中期出現的酶催化轉化法一般都是以馬來酸為底物，在馬來酸異構酶作用下制備富馬酸，但原料馬來酸供應不足，且價格昂貴。20世紀70年代石油危機的出現，使得人們加大了對微生物發酵法制備富馬酸的研究力度，這一時期人們用來發酵制備富馬酸的微生物有霉菌、酵母及細菌。其中根霉菌Rhizopus為重點研究的對象，具體包括米根霉Rhizopusoryzae、少根根霉Rhizopusarrhizus以及黑根霉Rhizopusnigricans等。在這一時期，我國科學家對微生物發酵法生產富馬酸的研究工作也進行了一定的探索，其中山西微生物研究所的白照熙等篩選出了具有產富馬酸能力的少根根霉，當振蕩培養于含有12％葡萄糖的培養基時，富馬酸產量為53.15g/L，得率為45％，同時產生了較多的副產物如蘋果酸等，但發酵周期較長，需要11天左右(食品與發酵工業，1988)。美國Purdue大學的Tsao教授等利用米根霉發酵產富馬酸，98g/L初始葡萄糖發酵48h，其富馬酸產量為33g/L，得率為33.7％(Bioprocess?Biosyst?Eng，2002，25：179～181)。

目前全世界富馬酸的生產能力為34萬t/a，其中我國富馬酸年產量達到5萬t左右，供求基本處于持平狀態。富馬酸的主要消費領域為不飽和聚Ra樹脂、紙漿料助劑、食品、醫藥等領域。我國富馬酸的應用范圍小，用途單一，隨著其應用領域的不斷拓展，尤其作為一種平臺化合物從它出發可以合成很多四碳化合物，在石油資源日益枯竭的情況下，其應用前景將越來越廣闊。因此，迫切需要一種廉價，高效生產富馬酸的方法。

生物酶法具有產物濃度高、收率高、純度高、副產物少和精制操作容易的優點，是一種較為有效的廉價生產富馬酸的方法。本申請通過克隆表達富馬酸酶，以L-蘋果酸為原料，酶促反應催化脫水的方法通過體外酶法來制備富馬酸，提供了一種廉價，高效生產富馬酸的方法，具有產物濃度高、收率高、純度高、副產物少和精制操作容易的優點。本發明還優化了反應和分離條件，進一步提高了轉化率和產品純度。

發明內容

本發明提供克隆、并在大腸桿菌中表達一個來自嗜熱棲熱菌(Thermus?Thermophilus?HB8)的富馬酸酶，其特征在于高表達量、高酶活、有機溶劑耐受及高溫穩定性。

本發明提供一種生物法生產富馬酸的方法。

前述方法采用一種以L-蘋果酸為原料，酶促反應催化脫水的方法來制備富馬酸。

前述方法，其特征在于優化了反應和分離條件，提高了轉化率和產品純度。

前述方法，其特征在于優化反應pH值，反應體系，特別是一定比例的有機溶劑的加入極大提高了轉化效率。

發明詳述