[發明專利]一種體外PXR激活特性篩查的方法

無效

• 申請號: 201110399995.X
• 申請日: 2011-12-06
• 公開（公告）號: CN102533925A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 高月;陸倍倍;王宇光;劉浩生;馬增春;梁乾德;肖成榮;譚洪玲;洪倩
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京太兆天元知識產權代理有限責任公司 11108
• 代理人: 張韜

技術領域

本發明涉及一種體外誘導劑的篩選方法，特別涉及體外PXR激活特性篩查的方法方法。

背景技術

機體維持正常生理功能必須將一些外源性物質代謝轉化為極性化合物排出體外，這一清除與解毒的過程主要依賴于肝臟系統細胞色素P450(CYP)基因表達調控來實現。同時治療各類疾病的藥物越來越多，聯合用藥已成為通常的治療手段，而藥物間相互作用引起的不良反應也隨之增加，其中很大部分與藥物相互作用有關。多數藥物發生相互作用的機制與藥物代謝相關，尤其是與細胞色素P450酶(cytochrome?P450，CYP450)有關的代謝。細胞色素P450是由許多同工酶組成的超大家族，參與藥物代謝的主要有CYP3A4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6等，其中CYP3A4是具重要意義的一族，大約50％的藥物經其代謝，其與藥物代謝最密切相關，因此有必要將藥物安全性評價引入到藥物研發的早期，通過相關篩選技術的建立發現可能存在的藥物相互作用，提高創新藥物的安全性。研究表明多種藥物可通過核受體PXR(孕烷X受體，Pregnane?X?Receptor，PXR)從而誘導CYP3A基因的表達。PXR蛋白全長434個氨基酸，其結構包括氨基端保守的DNA結合區和羧基端的配體結合區。藥物能直接與核內的PXR配體結合域結合，繼而與另一核受體視黃醛X受體(Retinoid?X?receptor，RXR，NR2B1)形成異二聚體，該異二聚體與靶基因啟動子上的外源性化學物反應元件結合，促進CYP3A的轉錄和酶蛋白的表達，同時加強其對底物的代謝能力。鑒于PXR在CYP3A酶的生成中發揮了重要的介導作用，PXR受體的激活會引起CYP3A酶的合成加速，不僅增加藥物本身的代謝，而且會加速體內其他藥物的代謝，誘發藥物-藥物相互作用。

報告基因法通過檢測外源物對PXR的激活能力來預測其對CYP3A4的誘導效應，是目前常用的篩選藥物相互作用的方法。比較了報告基因法與原代培養的人肝細胞模型在預測CYP3A4誘導劑時的相關性，結果表明兩種方法具有很好的相關性。Noracharttiyapot?W等將報告基因載體單獨穩定轉染HepG2細胞，篩選得到了對利福平有明確誘導效應的功能性單克隆細胞株，但其每次檢測熒光時均需要裂解細胞。

目前已鑒定出多種能與PXR/RXR二聚體結合的直接重復序列DR-3、DR-4、DR-5和DR-8等和反向重復序列ER-6和ER-8等應答元件。上述序列分布于多種與藥代動力學相關的代謝酶基因啟動子中，與cyp3a4相關的主要是位于近側啟動子區域的ER-6、位于轉錄起始位點上游7.2～7.8kb處的遠端外源物反應增強子模體(XREM)及位于轉錄起始位點上游8.8kb處的DR-3等。Fu-Jun?LIU等研究發現，轉錄起始位點上游7.2～7.8kb處的遠端外源物反應增強子模體(XREM)中的DR-3元件對PXR介導的利福平誘導至關重要，其缺失后利福平的誘導作用基本消失。

發明內容

本發明目的在于提供一種體外PXR激活特性篩查的方法方法。

本發明目的是通過如下技術方案實現，本發明體外PXR激活特性篩查的方法包括如下步驟：

1、報告基因載體的構建：

設計引物，以pGL3-3A4雙熒光素酶報告基因質粒為模板，用引物對dis-F/dis-R和pro-F/pro-R分別擴增CYP3A4啟動子遠端調控序列(-7833～-7208)和近端啟動序列(-361～+11)，將遠端調控序列和近端調控序列分別進行EcoR?I-EcoR?V和EcoR?V-Hind?III雙酶切，用T4連接酶將兩個雙酶切產物進行連接，然后用引物對dis-F/pro-R進行遠端調控序列和近端調控序列線性串聯片段的克隆，連入pGLuc-Basic載體的EcoR?I/Hind?III位點，轉化大腸桿菌，經酶切和測序驗證，載體命名為pGLuc-NEB-3A4-1，即1號；用dis-F-Bgl?II/dis-R-EcoR?I引物對擴增遠端片段，將其連入1號載體的Bgl?II/EcoR?I位點，轉化大腸桿菌，經酶切和測序驗證，載體命名為pGLuc-dou-dis-3A4-9，即9號；所述載體引物為

表1載體引物構建表

2、細胞培養：常規培養HepG2細胞于6孔板中，5％CO₂、37℃，培養基為MEM+10％FBS+1％NEAA，至細胞密度達50％布滿時，加入含G418的培養液1ml/孔，G418終濃度為900μg/ml，換液時保持G418濃度穩定不變，持續培養3周；