[發明專利]一種體外PXR激活特性篩查的方法

無效

• 申請號: 201110399995.X
• 申請日: 2011-12-06
• 公開（公告）號: CN102533925A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 高月;陸倍倍;王宇光;劉浩生;馬增春;梁乾德;肖成榮;譚洪玲;洪倩
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京太兆天元知識產權代理有限責任公司 11108
• 代理人: 張韜

1.一種體外PXR激活特性篩查的方法，該方法包括如下步驟：

1)、報告基因載體的構建：

設計引物，用引物對dis-F/dis-R和pro-F/pro-R分別擴增人CYP3A4啟動子遠端調控序列(-7833～-7208)和近端啟動序列(-361～+11)，將遠端調控序列和近端調控序列分別進行EcoR?I-EcoR?V和EcoR?V-Hind?III雙酶切，用T4連接酶將兩個雙酶切產物進行連接，然后用引物對dis-F/pro-R進行遠端調控序列和近端調控序列線性串聯片段的克隆，連入pGLuc-Basic載體的EcoR?I/Hind?III位點，轉化大腸桿菌，經酶切和測序驗證，載體命名為pGLuc-NEB-3A4-1，即1號；用dis-F-Bgl?II/dis-R-EcoR?I引物對擴增遠端片段，將其連入1號載體的Bgl?II/EcoR?I位點，轉化大腸桿菌，經酶切和測序驗證，載體命名為pGLuc-dou-dis-3A4-9，即9號；所述載體引物為

載體引物構建表

2)、細胞培養和G418工作濃度的篩選：常規培養HepG2細胞于6孔板中，5％CO₂、37℃，培養基為MEM+10％FBS+1％NEAA，至細胞密度達50％布滿時，加入含G418的培養液1ml/孔，G418終濃度為900μg/ml，換液時保持G418濃度穩定不變，持續培養3周；

3)、細胞瞬時轉染：HepG2細胞用MEM+10％FBS+1％NEAA進行培養；轉染前24h，按20×10⁴細胞/孔的量接種至24孔培養板中；轉染時將500ng?hPXR表達載體，300ng1號或9號，與2.5μL?LipofectamineTM?LTX轉染試劑孵育后加入至1個培養孔，轉染7h后更換為MEM+10％FBS培養基，培養12h后，更換為含有1μL?DMSO和10μM?RIF處理培養基，繼續培養，在加入RIF后24、48小時點上檢測熒光素酶活性；轉染和檢測共重復3次，每次轉染均設置復孔；

4)、穩定轉染細胞克隆：篩選采用G418壓力選擇和有限稀釋法克隆化，將9號和PXR表達載體共轉染HepG2細胞，瞬轉細胞用胰酶消化，做細胞計數，按每孔200個細胞轉移至96孔板，按終濃度900μg/ml加入含G418的MEM全培養基，培養3周后，獲得穩定生長的細胞克隆，將其依次轉移至24孔板、6孔板和培養瓶擴大培養；穩定轉染的細胞株用含500μg/ml?G418的MEM全培養基維持培養；

5)、穩定轉染細胞株被檢藥物(配基藥物)誘導鑒定：加藥前24小時，按10×10細胞/孔的量接種穩定轉染細胞株至96孔培養板中，每孔加入被檢藥物，使被檢藥物終濃度為10μM；在加入被檢藥物后于24h、48h吸取細胞培養液上清，進行熒光測定；

6)、數據的統計分析使用SAS?9.2軟件，對PXR激活特性進行篩選。

2.如權利要求1所述的體外PXR激活特性篩查的方法，該方法中的被檢藥物為任何化合物。

3.如權利要求2所述的體外PXR激活特性篩查的方法，該方法中的被檢藥物為克霉唑、地塞米松、硝苯地平、奧美拉唑或曲格列酮。