[發(fā)明專利]一種SPOP基因雜合性缺失的熔解曲線分析檢測試劑盒及其檢測方法和應用

無效

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• 申請日: 2011-12-06
• 公開（公告）號: CN102399893A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發(fā)明（設計）人: 楊竹;于超;余秋波;黎剛;吳蘭香;李春莉
• 申請（專利權）人: 重慶醫(yī)科大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明屬于醫(yī)學和生物學檢測領域，具體涉及一種SPOP基因雜合性缺失的熔解曲線分析檢測試劑盒及其檢測方法和應用。

背景技術

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)的三大惡性腫瘤之一，是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，早期無明顯癥狀，易造成患者忽視，70％-80％確診時已屬晚期。卵巢癌中以卵巢上皮性癌最為常見，占80％左右，手術治療效果不理想，術后59％患者2年內(nèi)復發(fā)或其他轉移，五年生存率僅30％左右。

目前紫杉醇聯(lián)合卡鉑治療卵巢癌有效率為60％左右，可作為卵巢癌術后化療及復發(fā)的一線化療方案。但紫杉醇和卡鉑均可出現(xiàn)耐藥，并具有較強的毒副作用。

卵巢癌的發(fā)生、侵潤和轉移涉及腫瘤轉移促進基因(metastasis?promoting?genes)和腫瘤轉移抑制基因(metastasis?suppressorgennes，MSG)的變化，是一個多因素、多步驟的連續(xù)過程。探討卵巢癌浸潤轉移發(fā)生的作用機制，就能為卵巢癌的檢測、輔助診斷、個體化治療和預后判斷提供新的靶點、新的指標。但迄今為止，明確的與卵巢癌發(fā)生相關的只有BRAC1和BRAC2基因突變，然而這部分患者只占到卵巢癌患者的5％左右。因此，為卵巢癌的診治尋找新的分子靶點是卵巢癌研究中的一個重點。

SPOP基因位于人染色體17q21的位點，在腫瘤細胞中具有高缺失率及雜合性缺失(loss?of?heterozygosity，LOH)現(xiàn)象。LOH的定義為導致與某一特殊基因正常的兩個成對等位基因出現(xiàn)不同的基因組變化；常反映喪失該基因的一個等位基因的部分或全部基因組序列。LOH一般都與腫瘤的抑制基因有關，在兩個等位基因都存在時，會抑制惡性腫瘤的發(fā)生。而當一個等位基因明顯異常或缺失時(另一個等位基因已經(jīng)處于沒有活性的狀態(tài))不再發(fā)生抑制惡性狀態(tài)，細胞就轉化為癌細胞。

近年來，學者在研究42種卵巢癌細胞株SPOP基因雜合性缺失(LOH)時，發(fā)現(xiàn)SPOP基因在卵巢癌來源的細胞株中顯著雜合性缺失(LOH)，如圖1所示。SPOP基因除了在卵巢癌中出現(xiàn)大量LOH外，在胃腸間質瘤，甲狀腺癌，腎癌，卵巢癌，食道癌等來源的細胞株中也出現(xiàn)大量的LOH。抑癌基因SPOP在卵巢癌中大量出現(xiàn)LOH，而正常卵巢組織中SPOP則不會出現(xiàn)這種LOH現(xiàn)象，因此，SPOP的雜合性缺失可作為卵巢癌的輔助診斷標志。

目前，檢測SPOP基因雜合性缺失(LOH)的方法主要是傳統(tǒng)的聚合酶鏈式反應(PCR)方法、傳統(tǒng)測序、變性高效液相色譜分析(dHPLC)、芯片雜交等方法。傳統(tǒng)PCR方法應用較廣，但因其是通過PCR后的產(chǎn)物電泳，通過判斷條帶的數(shù)量和分布來達到區(qū)分野生型、純合缺失、雜合性缺失的目的，其操作繁瑣，易出現(xiàn)假陽性和假陰性；傳統(tǒng)測序的靈敏度為20％左右，容易出現(xiàn)假陰性；dHPLC操作復雜、花費高，一般不適于臨床檢測；芯片雜交的方法花費較高，一般實驗室沒有此平臺，其應用于臨床檢測尚有許多限制因素。

發(fā)明內(nèi)容

因此，本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種檢測SPOP基因雜合性缺失的方法。

本發(fā)明的再一個目的是提供一種SPOP基因雜合性缺失的熔解曲線分析檢測試劑盒。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種SPOP基因雜合性缺失的熔解曲線分析檢測試劑盒在卵巢癌檢測過程中的應用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是：

提供一種SPOP基因雜合性缺失的高分辨率熔解曲線分析檢測試劑盒在卵巢癌檢測中的應用，其特征在于：該試劑盒由卵巢癌抑癌基因SPOP高分辨率熔解曲線分析的SPOP特異引物、DNA提取試劑(QIAamp?DNA?FFPE?Tissue?Kit)、LC480?HRM?master?mix、陽性質控DNA、陰性質控DNA組成；

其中，高分辨率熔解曲線分析的SPOP特異引物由兩對引物片段組成，其中一對擴增SPOP高頻LOH區(qū)的序列，擴增片段長度為120bp；另一對引物擴增SPOP基因以外兩端的序列，片段長度為100bp，其序列如下表。

其進一步特征在于：所述試劑組成包括：

1對SPOP基因擴增引物；

1對SPOP基因外兩端擴增引物；

LC480?HRM?master?mix；

DNA提取試劑(QIAamp?DNA?FFPE?Tissue?Kit)；

陽性質控DNA；

陰性質控DNA。