[發明專利]一種高純度雷莫拉寧的制備方法

有效

• 申請號: 201110394932.5
• 申請日: 2011-12-02
• 公開（公告）號: CN103130874A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 李寧;張雪霞;段寶玲;董愛華;李曉露;王海燕;林毅;張金娟;林旸;張麗
• 申請（專利權）人: 華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K1/22
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于工業微生物技術領域，具體涉及到一種從發酵培養物中制備高純度雷莫拉寧的方法。

背景技術

糖肽類抗生素是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(金葡球菌，MRSA)的首選藥物。自1959年萬古霉素用于臨床以來，它一直是治療革蘭氏陽性菌引起嚴重感染的最有效的藥物之一。絕大多數引起臨床感染的革蘭氏陽性菌，均對萬古霉素敏感。但隨著萬古霉素廣泛使用，以及臨床用藥中的不合理現象，導致了耐藥問題逐漸發生并有流行的可能，使得開發萬古霉素替代品迫在眉睫。雷莫拉寧（Ramoplanin，A-16686，MDL62）便是其中最有開發價值的品種之一，1984年，意大利Bruno等人在游動放線菌（Actinoplanes?sp.)中首次分離得到了一種新型抗生素——抗革蘭氏陽性菌的糖肽類抗生素雷莫拉寧。1989年完成結構確認，后由意大利Biosearch、Genome?Therapeutics等公司進行商業化開發。由于雷莫拉寧攻擊細菌的方式讓細菌無法輕易產生抵抗性，因此產生抗藥菌株的可能性較低，其前景被國外藥學專家十分看好。

雷莫拉寧是由A1、A2、A3、A1＇、A2＇、A3＇、Ramoplanose?7個組份組成的抗生素混合物,?由環多肽、配糖和脂肪酸鏈組成，其中，A2組份為雷莫拉寧的主組份，約占75%以上。雷莫拉寧7個組份均具有1個相同的母核,為17個氨基酸構成的環多肽，根據配糖為三糖、雙糖還是單糖以及脂肪酸鏈的不同，構成雷莫拉寧7個組份。雷莫拉寧的空間結構是由2個反向平行的β₂鏈構成，其分子內部的2～7?和10～14?位氨基酸殘基分別各形成1個β₂鏈，2個反向平行的鏈結構由8位的蘇氨酸殘基和9位的苯丙氨酸殘基形成的β2轉角連結起來。整個分子的拓撲結構呈U?型,在U型分子的開口處由15～17位的氨基酸殘基形成了1個Loop?環結構。雷莫拉寧結構如下圖：

?雷莫拉寧抑制細胞壁上肽聚糖的生物合成，其抑菌機制與萬古霉素及替考拉寧的抑菌機制不同。萬古霉素和替考拉寧對細菌細胞壁的抑制作用主要發生在肽聚糖鏈的延伸和交聯水平上，即作用于肽聚糖生物合成的后期，競爭性結合肽聚糖前體或發生特異性抑制作用，而雷莫拉寧的抑制作用發生在轉肽反應之前，是一種膜上反應的抑制物，具有抑制UDP-N-乙酰-D-葡萄糖胺的摻入作用。這種新的作用方式正是人們對雷莫拉寧感興趣的原因，因為只有抑制同一反應的不同步驟的抗生素,才有可能成為抑制病原菌耐藥問題的新型抗生素。

在體內、體外的試驗中,雷莫拉寧均表現出良好的廣譜抗菌活性,大部分病原菌(革蘭氏陽性)?對雷莫拉寧敏感性均高于萬古霉素和替考拉寧。另外,雷莫拉寧的細胞毒性要比其它糖肽類抗生素小且無明顯不良反應及腎毒性。目前,醫院在治療革蘭氏陽性菌(特別是葡萄球菌和腸球菌)?引起的臨床感染時可選用的抗生素十分有限,雷莫拉寧因其特殊的抑菌機制及良好的抑菌效果,在用于治療革蘭氏陽性菌引起的感染性疾病中有良好前景。

中國專利CN?101024662A公開了一種雷莫拉寧的純化方法，將雷莫拉寧粗提物與硅膠混合后，置于硅膠柱上，用甲醇與酸水作為流動相洗脫，由于硅膠為正相填料，長時間使用含水流動相會導致硅膠失活，導致層析分離能力下降，需經常更換硅膠，而且該方法所得產品純度較低（約85%）。中國專利CN?101838315A公開了一種雷莫拉寧的分離方法，采用大孔離子交換樹脂吸附后，用酸性甲醇水解吸，可達到較好的分離效果，但未能對雷莫拉寧各組分比例進行調整與控制。以上兩個專利中均在發酵液中調節pH，由于雷莫拉寧在酸性環境中溶解度很大，會造成有效成分丟失在濾液中。

發明內容

本發明的目的在于克服上述方法不足之處，得到高純度的雷莫拉寧制備工藝。本發明在發酵液過濾前加入助濾劑，有效凈化了菌絲體，在浸提過程調節pH，防止了發酵液直接調pH造成的有效成分丟失，根據雷莫拉寧化學結構中羥基多的特點，采用聚酰胺分離純化雷莫拉寧，實現了雷莫拉寧各組分與雜質的高效分離，可得到高含量的雷莫拉寧精粉，純度大于95.0%，總收率大于85%。本發明工藝簡便，適于工業化規模生產高純度雷莫拉寧。

在本發明方法中，在雷莫拉寧發酵液中加入助濾劑，過濾得菌絲體，用酸性極性溶劑浸提菌絲體，濃縮浸提液，過濾得粗提物，粗提物用極性溶劑與水的混合液稀釋后，用聚酰胺柱吸附，再用極性溶劑與水的混合液洗脫，濃縮、過濾、干燥，得到高純度雷莫拉寧精粉。