[發明專利]通用熒光標記探針的PCR-LDR基因多態性測序方法無效

申請號：	201110391898.6	申請日：	2011-11-30
公開（公告）號：	CN102409101A	公開（公告）日：	2012-04-11
發明（設計）人：	陸炯;陳軼群;肖君華	申請（專利權）人：	上海翼和應用生物技術有限公司
主分類號：	C12Q1/68	分類號：	C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
代理公司：	上海泰能知識產權代理事務所 31233	代理人：	黃志達;謝文凱
地址：	201600 上海市松***	國省代碼：	上海;31
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摘要：
搜索關鍵詞：	通用熒光標記探針 pcr ldr 基因多態性方法
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于基因多態性位點檢測領域，特別涉及一種通用熒光標記探針的PCR-LDR基因多態性測序方法。

背景技術

隨著人類藥物基因組學的發展，越來越多的研究成果將要運用于臨床診斷中，這就要求有大規模的基因多態性位點檢測方法。這些年來，將連接反應用于檢測基因多態性位點越來越引起人們的重視，國外學者已經做了大量的研究(France?Barany?et?al.，Proc.Nat’l?Acad.Sci.USA，88：189-93(1991)，The?Ligase?Chain?Reaction(LCR)in?a?PCR?World，PCR?Methods?and?Applications，1：5-16(1991))。連接酶鏈式反應(ligase?chain?reaction，LCR)是指在反應中設計兩對探針，使得連接反應可以指數擴增模板。連接酶檢測反應(ligase?detection?reaction，LDR)是在反應中僅加入一對探針，模板被線性擴增。

近幾年，出現了將LDR技術和PCR技術關聯使用，以及LDR技術、PCR技術和基因芯片技術，測序技術關聯用于基因多態性位點檢測(Norman?P.Gerry1?et?al.，J.Mol.Biol.(1999)292，251-262，U.S.Pat.Pub.No.2003/0032016A1)，這些技術的出現大大方便了基因位點的檢測，但同時在這些技術中，存在著大量的需要熒光標記的探針，而這些標記的探針往往成本昂貴，為開發和應用造成不便。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種通用熒光標記探針的PCR-LDR基因多態性測序方法，以填補現有技術中通用標記探針完成探針標記的空白，克服檢測過程復雜的缺陷。

本發明的第一方面提供一組用于基因多態性測序的核酸序列包括：

a)至少一條LDR標記探針，包括三部分，第一部分位于5’端且和待測模板嚴謹配對，第二部分位于3’端且和通用模板5’序列嚴謹配對，第三部分位于上述兩部分序列中間，是一段用于調整探針長度的、和待測模板或通用模板或其他探針序列均無同源性的隨機序列，該探針的5’磷酸化；

b)2到4條LDR檢測探針，每條包括兩部分，一部分位于3’端且和待測模板嚴謹配對，另一部分位于5’端是一段用于調整探針長度的、和待測模板或通用模板或其他探針序列均無同源性的隨機序列，且該2到4條檢測探針通過設計長度不同的隨機序列使檢測位點上不同的2到4種堿基對應不同的LDR產物長度；

c)至少一條通用熒光標記探針，該探針的5’端磷酸化，3’端用熒光標記并且和通用模板

d)的5’端序列嚴謹配對；

d)至少一條通用模板，其5’端序列和所述通用熒光標記探針c)嚴謹配對，其3’端序列和所述LDR標記探針a)嚴謹配對。

上述的一組用于基因多態性測序的核酸序列的一種優選方式為，所述的待測模板為待測序的多態性序列經PCR擴增后的產物。

上述的一組用于基因多態性測序的核酸序列另一種優選方式為，其特征在于，所述的LDR標記探針a)和LDR檢測探針b)與待測模板嚴謹配對部分的長度范圍均為10-25個核苷酸。

上述的一組用于基因多態性測序的核酸序列又一種優選方式為，所述的核酸序列a)-d)中的只是一種為DNA。優選地，所述的核酸序列a)-d)均為DNA。

本發明的第二方面提供一種基因多態性測序方法，包括如下步驟：