[發(fā)明專利]用于杏鮑菇遺傳轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110386602.1
• 申請(qǐng)日: 2011-11-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102433330A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許峰;劉宇;尹永剛;王守現(xiàn);趙爽;王鵬;耿小麗;王蘭青;孟莉莉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京市農(nóng)林科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12N15/63;C12N15/113;A01H15/00
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于杏鮑菇遺傳轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

杏鮑菇(Pleurotus?eryngii)又名刺芹側(cè)耳，隸屬于擔(dān)子菌亞門(Basidio?mycotina)，層菌綱(Hymenomycetes)，無(wú)隔擔(dān)子菌亞綱(Homobasidiomycetidae)，傘菌目(Agaricales)，側(cè)耳科(Pleurotaceae)，側(cè)耳屬(Pleurotus)。杏鮑菇是近年來(lái)開(kāi)發(fā)栽培成功、適于工廠化栽培的珍稀食用菌新品種，其風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富，能夠產(chǎn)生多種生物活性分子和酶，且其多糖具有較好的降血糖、增強(qiáng)肌體免疫功能、抗腫瘤和抗氧化活性，因此杏鮑菇具有很高的食用、藥用、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值，市場(chǎng)前景廣闊。杏鮑菇在北京市場(chǎng)上已經(jīng)占食用菌總產(chǎn)量的5.01％。杏鮑菇生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)、生物轉(zhuǎn)化率較低，限制了杏鮑菇及其生物活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，因此基于杏鮑菇遺傳發(fā)育機(jī)理的基礎(chǔ)研究亟待加強(qiáng)。

高效的食用菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立是從事分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)。杏鮑菇高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，將為其遺傳發(fā)育機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)，為其分子育種提供技術(shù)支持，為新型生物反應(yīng)器的研發(fā)提供儲(chǔ)備，為杏鮑菇及其生物活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用提供前提條件，具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于杏鮑菇遺傳轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種DNA片段，自上游至下游依次包括啟動(dòng)子和終止子(杏鮑菇三磷酸甘油醛脫氫酶基因終止子)；所述啟動(dòng)子的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述終止子的核苷酸序列如序列表的序列2所示。

所述DNA片段還包括抗性篩選基因。所述抗性篩選基因具體可為序列表的序列3自5’末端第763-1793位核苷酸所示的hph基因。

所述DNA片段可用于制備轉(zhuǎn)基因杏鮑菇。

含有所述DNA片段的重組質(zhì)粒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述重組質(zhì)粒(重組質(zhì)粒甲)具體可為在pUC19質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)間自上游至下游依次插入所述啟動(dòng)子和所述終止子得到的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒優(yōu)選為將pUC19質(zhì)粒Sph?I和Sal?I酶切識(shí)別序列之間的小片段取代為所述啟動(dòng)子，BamH?I和Sac?I酶切識(shí)別序列之間的小片段取代為所述終止子得到的重組質(zhì)粒。

所述重組質(zhì)粒(重組質(zhì)粒乙)具體還可為在以上所述重組質(zhì)粒(重組質(zhì)粒甲)的所述啟動(dòng)子和所述終止子之間插入含有外源基因的DNA片段得到的重組質(zhì)粒。所述含有外源基因的DNA片段可包括所述外源基因和抗性篩選基因。所述抗性篩選基因具體可為序列表的序列3自5’末端第763-1793位核苷酸所示的hph基因。所述外源基因具體可為序列表的序列3自5’末端第1-726位核苷酸所示的egfp基因。所述含有外源基因的DNA片段具體可為序列表的序列3所示的DNA片段。

所述重組質(zhì)粒可用于制備轉(zhuǎn)基因杏鮑菇。

用所述重組質(zhì)粒制備轉(zhuǎn)基因杏鮑菇的方法可為：將所述重組質(zhì)粒(重組質(zhì)粒乙)轉(zhuǎn)化杏鮑菇的原生質(zhì)體，培育后得到轉(zhuǎn)基因杏鮑菇。所述轉(zhuǎn)化具體可通過(guò)PEG/CaCl₂介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。

用所述重組質(zhì)粒制備轉(zhuǎn)基因杏鮑菇的方法可包括如下步驟：

(1)用溶壁酶裂解平菇菌絲，得到原生質(zhì)體；

(2)將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入所述原生質(zhì)體，培養(yǎng)后得到轉(zhuǎn)基因平菇。

所述步驟(1)具體可為：將平菇菌絲懸浮于1.5g/100mL的溶壁酶溶液，32℃、60rpm溫浴30小時(shí)，過(guò)濾并收集濾液，然后將所述濾液3000rpm離心10min并收集沉淀，然后將所述沉淀洗滌后懸浮于MMC緩沖液中，即為原生質(zhì)體溶液。

MMC緩沖液由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶劑為50mM馬來(lái)酸緩沖液(pH?5.5)；所述溶質(zhì)及其在MMC緩沖液中的濃度如下：0.5M甘露醇、5mM?CaCl₂。

所述步驟(2)可為：將步驟(1)的原生質(zhì)體和所述重組質(zhì)粒在PTC緩沖液中混合均勻，依次進(jìn)行冰浴和室溫靜置，離心收集沉淀。

所述步驟(2)具體可為：將70μl步驟(1)得到的原生質(zhì)體溶液和20μg重組質(zhì)粒(具體可為10μl?2μg?μl^-1的重組質(zhì)粒溶液)震蕩混勻，然后加入50μl?PTC緩沖液并震蕩混勻(1s×6次)，然后冰浴25min，然后加入1ml?PTC緩沖液后室溫靜置20min，3000rpm離心10min，收集沉淀。